巴布亚企鹅(Pygoscelis papua)精子形态及超微结构观察

于丽娜,罗 珺,李艳秋,刘友林,贾一帆, 赵诗文, 王 伟

(1.大连圣亚海洋生物研究所,辽宁 大连 116023;2.大连海洋大学,辽宁 大连 116023)

巴布亚企鹅(Pygoscelispapua)又名白眉企鹅、金图企鹅,身长60～80 cm,重约6 kg,眼睛上方有一个明显的白斑,嘴细长,嘴角呈红色,眼角处有一个红色的三角形,显得眉清目秀。因其模样憨态有趣,有如绅士,十分可爱,因而俗称“绅士企鹅”,平均寿命为20年。巴布亚企鹅的自然分布数量正在迅速减少,根据世界自然保护联盟(IUCN)调查显示,巴布亚企鹅的数量接近近危[1]。为了保护巴布亚企鹅,迁地保护成为一种重要的生物资源保护方式和策略[2],迁地保护主要是在动物园、水族馆中进行。2000年我国首次引进16只巴布亚企鹅,随后成功繁殖12只幼企鹅[3]。国外企鹅的迁地保护比国内进行得早。1919年,爱丁堡7只王企鹅中的一对成功孵化并养育了一只小企鹅,这是圈养企鹅群首次成功繁殖。本研究通过对巴布亚企鹅精子形态的观察,将为企鹅精子形态学研究和评价提供素材,也为进一步开展巴布亚企鹅人工繁育和迁地保护工作提供技术支持。

精子超微结构研究是检验精液品质、揭示精子发生机制、开展受精生物学研究的一项重要内容[4]。精子的形态和品质会直接影响穿卵能力和母体的受孕率[5-7],对研究企鹅授精机制、繁殖和种质资源库建设[8-9],特别是对利用人工繁育保护濒危物种的应用具有重要意义[10]。巴布亚企鹅精子形态的扫描电镜和透射电镜研究尚未见报道,本研究使用扫描电镜和透射电镜对5只正处于繁殖期的巴布亚企鹅精子进行形态观察,观察其表面的结构,阐明巴布亚企鹅精子的超微结构,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物及精液的采集

达到性成熟的雄性巴布亚企鹅5只,来源于大连圣亚旅游控股股份有限公司。其繁育区陆地面积200 m2,水体体积90 m3,温度控制在-1～0 ℃,水温控制在5～8 ℃,光照强度控制在1 500～2 000 lx。

采精前将雄性企鹅单独在企鹅展厅中进行隔离,采精时工作人员一只手抱住企鹅固定身体和翅膀,另一只手握住腿;另一名工作人员对企鹅进行刺激,左手抚摸腹部,右手抚摸背部,用脱脂棉轻轻刺激泄殖腔。采集过程中要求无粪便、血液等污染物,采集到的精液立即放入冻存管中,每只雄性企鹅精液采集时间为5～8 min。采集后将雄性企鹅放回繁育区,观察到人工采精并没有影响雄性巴布亚企鹅筑巢和配对行为。

1.2 精子扫描电镜观察

固定:从冻存管用胶头滴管小心吸取新鲜精液,此过程中为减少对样本的机械损伤,要在1～3 min内完成取样,均匀涂布于≤3 mm2组织块,用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻漂洗去除杂质,并对需要扫描的面进行标记。迅速投入到扫描电镜固定液室温固定2 h,随后转移至4 ℃冰箱中保存。

后固定:采用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.4)对固定好的精液样品漂洗3次,每次15 min。并使用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.4)配制1%锇酸,室温下避光固定1～2 h。再次采用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.4)对精液漂洗3次,每次时长为15 min。

脱水:将样品依次放入30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇进行梯度脱水,每次15 min;放入100%乙醇脱水30 min;再放入100%乙酸异戊酯置换15 min。

干燥:将巴布亚企鹅精子样本放入临界点干燥仪内进行干燥。

样本导电处理:将企鹅精液样本放入离子溅射仪样品台上喷金30 s左右,此过程精子样本需紧贴于导电碳膜双面胶上。

扫描电子显微镜下观察,进行精子图像分析。

1.3 精子透射电镜观察

固定:将新鲜精液吸入离心管内,放入离心机,以≤3 000 r/min离心2 min,细胞团要有绿豆大小。去培养基后样本中加入电镜固定液,在4 ℃冰箱中进行保存。

琼脂预包埋:精液采用离心机<3 000 r/min离心2 min,弃去上清液,加入0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 值7.4),混匀漂洗3 min后再于<3 000 r/min离心2 min,重复漂洗3次。提前加热溶解,制备1%琼脂糖溶液,稍冷却后加入EP管内,在琼脂糖凝固之前将沉淀用镊子挑起,使悬浮物包裹于琼脂糖内。

后固定:使用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.4)配制1%锇酸,室温下进行避光固定2 h。采用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值7.4)对精子样本漂洗3次,每次15 min。

室温脱水:样品依次放入30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇进行梯度脱水,每次20 min;再放入100%乙醇脱水40 min;然后用100%丙酮置换30 min。

渗透与包埋:脱水后样本采用丙酮∶812包埋剂=1∶1的体积比例,在37 ℃静置2～4 h;丙酮∶812包埋剂=1∶2的体积比例在37 ℃下静置开盖过夜;再用纯812包埋剂在37 ℃静置5～8 h,然后将纯812包埋剂倒入包埋板,37 ℃烤箱处理12 h以上。

聚合:将渗透与包埋后的样品在恒温箱内60 ℃聚合2 d,取出树脂块,备用。

超薄切片:用超薄切片机对树脂块进行切片,厚度为60～80 nm,用150目方华膜铜网捞起,放入培养皿中。

染色:对切片进行双重染色,将铜网放在2%醋酸铀饱和乙醇溶液避光染色8 min;用70%乙醇清洗3次;超纯水清洗3次;使用2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8 min;超纯水清洗3次,滤纸吸出多余的水分后将铜网切片,放入铜网盒内,在室温下进行干燥。

透射电子显微镜下观察,对巴布亚企鹅精子进行图像分析。

2 结果与分析

2.1 企鹅精子的外部形态

通过扫描电镜,观察到巴布亚企鹅精子主要由头部11.40～11.60 μm(见图1 A)、中段1.83～2.69 μm(见图1 B)和尾部47.50～59.74 μm(见图1 C)组成,属于典型的鞭毛精子。

2.2 巴布亚企鹅精子的超微结构

通过透射电镜观察到巴布亚企鹅精子的头部长而窄,呈椭球形(见图2A)。在巴布亚企鹅精子的中段发现了0.61～0.81 μm自噬体,呈新月形(见图2B)。巴布亚企鹅精子的尾部细长,呈鞭毛状(见图2C);同时观察到了9+2微管结构,长0.30～0.42 μm,与尾部中心轴平行排列(见图2D)。

图1 巴布亚企鹅精子扫描结果Fig.1 Gentoo penguin sperm scan results

图2 巴布亚企鹅精子透射结果Fig.2 Sperm transmission results of Gentoo penguin

3 讨论与结论

本研究中,通过腹部按摩采集企鹅精液的技术,由饲养人员进行无创精液样本采集[11],这使雄性企鹅的压力和胁迫感降低。通过观察人工采精行为并没有影响雄性巴布亚企鹅筑巢和配对行为。

本研究对巴布亚企鹅精子进行了扫描电镜和透射电镜观察,经扫描电镜观察巴布亚企鹅精子与其他动物正常精子的形态与结构存在着一定的差异,但是都具有相似的结构特点:精子总体能够分成头部、中段及尾部,属于典型的鞭毛精子。目前只有少数鸟类的精子形态计量学数据,其中记录最多的是公鸡、火鸡和鹌鹑[12-14]。本研究观察到巴布亚企鹅和王企鹅精子的头部与公鸡相似[9],鸟类精子的长度一般总长度为30～300 μm。根据扫描电镜和透射电镜观察到,巴布亚企鹅精子的头部呈椭球形,长11.40～11.60 μm;中段较短,长1.83～2.69 μm;尾部细长,长47.50～59.74 μm。非雀形目鸟类的每个精子组分的尺寸表现出一致性,精子头部长度在11.57～13.60 μm之间,中段长2.06～3.16 μm,尾部长47.22～53.57 μm[15]。此次研究中巴布亚企鹅精子的形态学计量数据也在此范围中,并且通过透射电镜观察到巴布亚企鹅精子的超微结构,9+2微管结构长0.30～0.42 μm与尾部中心轴平行排列;自噬体呈新月状,长0.61～0.81 μm。

本研究阐明了巴布亚企鹅精子的超微结构,对巴布亚企鹅授精机制、繁殖和种质资源库建设提供了基础,为有效遏制巴布亚企鹅遗传多样性的降低、也为珍稀动物巴布亚企鹅迁地保护提供技术支持。