黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫毒力及其解毒酶系活性的影响

李晶 李娜 付麟雲 刘锦霞 丁品 张建军 武建荣 王萍

摘要：黏虫（Mythimna separata）是典型的杂食性迁飞性农业害虫，每年都给我国的农业生产造成极大的经济损失。测定黄帚橐吾（Ligularia virgaurea）乙醇提取物对黏虫幼虫的毒力，并从细胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）、酸性磷酸酯酶（ACP）和碱性磷酸酯酶（ALP）等解毒酶系活性的角度研究黏虫幼虫对该药物的生理生化响应。结果表明，黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫幼虫有较强的生物活性，LC₅₀为3.655 mg/mL；CYP450活性在前8 h略有上升，12 h后显著降低（P<0.05）；GST活性在4 h时被显著激活，随后受到极显著抑制（P<0.01）；3种酯酶活性整体表现出逐渐降低的趋势。上述酶活性变化表明CYP450和GST可能参与了黏虫对黄帚橐吾提取物的代谢过程，但其最终被显著抑制的结果提示黄帚橐吾源农药较难使黏虫产生抗药性，具备被开发成为新型生物农药的潜力。

关键词：黄帚橐吾；生物农药；黏虫；代谢酶活性；抗药性；毒力

中图分类号：S476文献标志码：A文章编号：1003-935X（2023）01-0011-07

Effect of Ethanol Extract from Ligularia virgaurea on Toxicity and Activity of Detoxifying Enzymes of Mythimna separata

LI Jing¹， LI Na¹， FU Lin-yun¹， LIU Jin-xia¹， DING Pin¹， ZHANG Jian-jun¹， WU Jian-rong¹， WANG Ping²

（ 1.Institute of Biology，Gansu Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China； 2.The Public Welfare Forest Office of Minqin County，Gansu Province，Minqin 733399，China）

Abstract：Mythimna separata is a typical omnivorous migratory agricultural pest，which causes great economic losses to China's agricultural production every year. We determined the toxicity of ethanol extract of Ligularia virgaurea to M. separata larvae，and studied the physiological responses by measuring detoxifying enzyme activity such as cytochrome P450 （CYP450），glutathione-S-transferase （GST），carboxylesterase （CarE），acid phosphatase （ACP） and alkaline phosphatase （ALP）. The results showed that the ethanol extract from L. virgaurea had a strong bioactivity against M. separata larvae，with LC₅₀of 3.655 mg/mL. The activity of CYP450 increased slightly in the previous 8 hours and then decreased in the next 12 hours（P<0.05）.The activity of GST was significantly activated at 4 hours and then significantly inhibited （P<0.01）. And the activities of 3 kinds of esterase showed a trend of gradual decrease.

收稿日期：2022-08-08

基金項目：甘肃省科学院应用研究与开发项目（编号：2019JK-10）。

作者简介：李 晶（1983—），女，硕士，副研究员，研究方向为生物农药研发。E-mail：eyre326@163.com。

通信作者：刘锦霞，研究员，研究方向为生物农药产品研发及农业绿色病虫害防控技术研究。E-mail：liujinx0168@163.com。

All of these results indicated that CYP450 and GST may be involved in the metabolism，but the inhibition indicated that extract from L. virgaurea was difficult to induce resistance of M. separata larvae. Therefore，the extract from L. virgaurea had the potential to be developed as a new biopesticide.

Key words：biopesticide；Mythimna separate；activity of metabolic enzyme；herbicide resistance；toxicity

黏虫（Mythimna separata）是典型的远距离迁飞性鳞翅目农业害虫^［1］，可危害16科104余种植物，尤其喜食小麦、玉米、高粱、水稻等禾本科植物，因其杂食性、迁移性、间歇暴发性，给我国及世界农业生产造成了严重的经济损失。目前，黏虫仍以化学药剂防治为主^［2］。由于化学杀虫剂的连续使用，黏虫对拟除虫菊酯类等化学杀虫剂已产生较严重的抗药性^［3］，防效降低，且施药次数和用药量增多，增加了防治成本，造成环境污染和食品安全性降低。因此，施用生物农药等绿色防控技术成为黏虫防治的研究热点^［4］。

黄帚橐吾（Ligularia virgaurea）为菊科橐吾属多年生草本植物^［5］，在我国青藏高原东缘有所分布，尤其是在高寒退化草场，因过度放牧等干扰因素的影响，黄帚橐吾逐渐扩张成为优势种而被称为“退化指示种”^［6］。一些化学药剂能够发挥清除草原毒杂草的作用^［7-8］，但同时会威胁其他牧草的安全^［9］，且其残留成分的累积效应^［10］，将对整个草场生态系统产生潜在威胁。近年来，关于黄帚橐吾利用价值开发的报道越来越多：黄帚橐吾茎叶甲醇提取物对菜粉蝶幼虫有较强的拒食和触杀作用^［11］，对水稻纹枯病病菌和玉米大斑病病菌也有较强的抑制作用^［12］。笔者所在团队的研究显示，黄帚橐吾乙醇提取物对保护地辣椒4种常见的真菌性病原菌及其所致病害有较好的抑菌及防治效果，防效可达75%以上^［13］；对棉铃虫有很强的农药生物活性，主要表现为对受试害虫较强的胃毒和拒食作用^［14］。开发黄帚橐吾的综合利用价值，对于该草原毒杂草的综合治理有着积极的作用。

植物源化合物作用于昆蟲后，会通过影响昆虫体内不同关键酶的活性，从而对昆虫取食行为、生长发育或繁殖产生不利影响，甚至对其产生直接毒杀作用^［15-16］。经过长期进化，昆虫通过解毒代谢来分解植物源化合物以减轻其危害^［17］或者通过昆虫肠道、脂肪体等合成和分泌细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）、羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）^［18］等众多解毒酶来代谢有害化合物^［19］。昆虫体内解毒酶的变化可以指示植物源化合物的毒害作用以及昆虫对毒害的适应，能够反映植物源化合物与昆虫的互作机制^［20］。

本研究测定了黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫幼虫的室内毒力以及黏虫经药物处理后体内关键解毒酶系的变化，以期明确黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫的生物活性和解毒酶对此的响应，旨在为黏虫生物防控农药的进一步研发提供理论依据，为开发黄帚橐吾的综合利用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黏虫卵由吉林省农业科学院提供，孵化条件：25～30 ℃，相对湿度60%～70%。孵化后，人工饲养至2～3龄备用。

提取物制备及药液配制：2021年7—8月于甘肃省甘南藏族自治州退化草场采集黄帚橐吾地上植株。将所采材料清洗干净，并充分阴干，用粉碎机粉碎。采用冷浸法进行提取：将植株干材料与90%乙醇按照体积比1 ∶10混匀浸泡，每隔12 h翻搅混匀1次，浸泡72 h后，将浸出液用16层纱布滤出。如此反复操作3次。浸出液用2层中速滤纸抽滤后减压蒸馏，条件为30～35 ℃，0.075～0.080 MPa，最终得到褐色有特异气味的浸膏。

测定酶活性的酶联免疫试剂盒均购自上海优选生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 药液配制 将吐温-80作为助溶剂，与浸膏按照0.1 mL/g的比例混匀，再用水配制成200、10.0、5.0、2.5、1.0 mg/mL的药液，对照为吐温-80水溶液，浓度相当于最高浓度药液所加量。

1.2.2 试虫室内毒力测定 采用浸叶法对黏虫进行室内毒力的测定。选取叶宽、叶色等指标基本一致且完整的玉米叶片洗净晾干后制成1 cm长的小段，浸入不同浓度的药液中5 s，取出晾干后，取1段放置在垫有潮湿滤纸的培养皿中。选取大小和活力基本一致、经8 h饥饿处理的2～3龄黏虫幼虫各15头，放在相同浓度药液处理的叶碟上，每个叶碟1头虫，每组处理重复3次。对照组喂食经对照溶液处理的叶片。48 h后调查死亡虫数，计算半致死浓度（LC₅₀）。

1.2.3 酶液制备 按照LC₅₀配制好药液，将宽度、叶色等指标基本一致且完整的玉米叶片剪成等长小段，浸入药液5 s，取出晾干。将人工饲养至2～3龄的黏虫幼虫进行12 h饥饿处理，然后用处理好的叶片喂养试虫，分别于处理后2、4、8、12、24、48 h随机取10头幼虫，投入液氮速冻。随后用0.01 mol/L磷酸缓冲液研磨，3 000 r/min、4 ℃ 离心20 min，取上清，-80 ℃冷冻备用。

1.2.4 解毒酶活性测定 细胞色素P450（CYP450）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）、酸性磷酸酯酶（ACP）和碱性磷酸酯酶（ALP）的活性按照试剂盒中的检测方法进行测定，最终反应液于450 nm处测定吸光度并计算酶活性。蛋白含量按照BCA试剂盒中的检测方法进行测定，最终反应液于562 nm处测定吸光度并计算。酶活性计算公式如下：

式中：C_U表示测定管酶活性浓度，U/mL；V_U表示酶活性待测液体积，mL；N表示稀释倍数（5倍）；C_P表示测定管蛋白质浓度，μg/mL；V_P表示蛋白待测液体积，mL。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件对所测数据进行统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，用One-Way ANOVA中的Duncan's新复极差法对植物提取物不同浓度间的数据进行单因素方差分析，并进行多重比较；用One-Way ANOVA中的LSD法分析不同处理时间下的酶活数据差异；用Regression中的Probit计算LC₅₀；采用Excel 2019制图。

2 结果与分析

2.1 黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫幼虫的毒力

黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫幼虫具有较强的毒力，其大小与药物浓度呈正相关（表1）。药物浓度为20.0 mg/mL时，试虫校正死亡率达到9762%，与其余浓度处理的试虫校正死亡率相比具有极显著差异；随着药物浓度的降低，校正死亡率也逐渐下降。黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫幼虫的LC₅₀为3.655 mg/mL。

2.2 黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫幼虫体内解毒酶系活性的影响

2.2.1 细胞色素P450活性

经提取物处理4 h时，黏虫幼虫体内的细胞色素P450（CYP450）活性呈现被激活的趋势（图1），但仅略微上升，且与对照相比未表现出显著差异。随即CYP450活性迅速下降，虽有波动，但整体表现为被显著抑制（P<0.05）的状态，在12、24、48 h时，酶活性分别下降了41.8%、18.3%、73.8%。

2.2.2 谷胱甘肽-S-转移酶活性

黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫幼虫的GST活性表现出抑制-激活-抑制的作用（图2）。用药2 h时，GST活性被极显著（P<0.01）抑制；用药4 h时，GST活性表现为极显著（P<0.01）激活，活性增长了18.2%；随后GST活性受到较强抑制，至用药48 h时，提取物使GST的活性降低了77.0%。

2.2.3 羧酸酯酶活性

经药物处理后，黏虫幼虫的CarE活性迅速被抑制，用药2、4 h时，酶活性分别降低了25.2%和25.9%，与未处理试虫的CarE活性差异极显著（P<0.01）。用药8 h及12 h时，CarE活性回升至对照水平，但未表现出激活效应，24 h和48 h酶活性急剧降低了42.6%和65.0%（图3）。

2.2.4 酸性磷酸酯酶活性

药物处理2 h，黏虫幼虫的ACP活力下降，与对照相比表现出极显著（P<0.01）差异；4 h和8 h时，ACP活性均在较低水平波动。至12 h时，ACP活性有所回升；24、48 h 时，ACP活性急剧下降，48 h时ACP活性下降了72.3%（图4）。

2.2.5 碱性磷酸酯酶活性

黄帚橐吾乙醇提取物对黏虫幼虫的ALP活性抑制作用较为明显。药物处理后，随着时间的延长，ALP活性呈下降趋势。至24 h时，ALP活性开始急速降低，24、48 h的酶活性分别降低42.8%、65.3%（图5）。

3 讨论与结论

黄帚橐吾是高寒退化草场中的标志性毒杂草，因其含有多种植物次生代謝物质和难闻气味，家畜不采食^［21］。从而使其在高寒退化草场中的种群不断扩大，已成为青藏高原高寒草场中分布最广、危害极大的优势毒草，严重影响了该地区的群落结构和草场质量^［22］。开发利用其生物农药价值，一方面可以为生物农药资源的发掘贡献新生力量，另一方面也为退化草场毒杂草的综合治理提供了新途径。

胡冠芳等研究发现，黄帚橐吾甲醇提取物的10倍稀释液对4龄菜粉蝶幼虫的触杀死亡率为83.33%，拒食率为82.23%^［11］；刘锦霞等研究黄帚橐吾乙醇提取物对3龄棉铃虫幼虫的生物活性时，发现其有较强的触杀和胃毒活性，浓度为 10 mg/mL 时，触杀和胃毒校正死亡率分别为8467%和81.36%，其LC₅₀在3.00 mg/mL左右^［14］。本研究结果显示，黄帚橐吾乙醇提取物对2龄黏虫幼虫的毒力较强，药物浓度大于 5.0 mg/mL 时，校正死亡率均在50%以上，LC₅₀为3.655 mg/mL，此结果表明黄帚橐吾乙醇提取物可以有效防控黏虫幼虫的危害。黏虫、菜粉蝶幼虫和棉铃虫均为鳞翅目昆虫，这提示黄帚橐吾乙醇提取物可能对鳞翅目昆虫有相似的农药活性，此观点还需更详尽的试验予以验证。以此为切入点，黄帚橐吾源农药的作用谱和更精准的作用方式与机制还需要进一步的深入研究。

植物源化合物作用于试虫后，通过影响其体内的各个关键酶系活性，从而影响其生长、代谢的关键节点，并最终阻碍试虫的正常生命活动。各种解毒酶对药物处理作出的反应可能与该药物的作用途径和毒性强弱有关。本试验结果表明，经半致死浓度的黄帚橐吾乙醇提取物处理后，黏虫幼虫的CYP450活性在前8 h和对照组处于同一水平，略微有所上升；GST活性在4 h时极显著高于对照（P<0.01），说明黄帚橐吾乙醇提取物对这2种酶有激活作用，也表明这2种酶参与了试虫体内对于黄帚橐吾乙醇提取物的代谢过程。Birnbaum等的研究表明，昆虫摄入有毒化合物后其体内CYP450和GST的表达和催化活性会升高，以协助其度过毒物胁迫，维持个体发育和生存^［20］，本研究结果与此观点一致。此外，解毒代谢是一个高耗能的过程^［23］，从长远来看，黏虫幼虫通过升高解毒酶活性以代谢黄帚橐吾提取物需要消耗大量能量，是一个不利于试虫正常生存发育的过程。

GST会促使谷胱甘肽与外源物质形成共轭解毒物质^［24］，CYP450是昆虫代谢外源性化合物的中心酶，具有活化氧分子和与底物结合的双重功能^［25］。这2种酶活性的改变与昆虫对药物的抗性代谢密切相关，外源性物质诱导GST和CYP450活性增加，从而使其解毒能力提高，抗药性也得到增强^［26］。本研究结果显示，经黄帚橐吾乙醇提取物处理后，试虫的GST和CYP450活性被短暂激活以抵御外源物质，随后即被显著抑制，抑制率达到70%以上，说明黄帚橐吾源农药可能较难使黏虫幼虫产生抗药性，具备开发成为新型生物农药的潜力，在黏虫的绿色防控中有较高的应用价值和良好的开发前景。

CarE等酯酶是昆虫体内三大解毒酶系之一，大量研究表明昆虫受到外源药物影响时，其体内的酯酶均会有所响应。黄敏燕等研究发现，喂食0.5%单宁、0.2%芸香苷以及1%没食子酸后，斜纹夜蛾体内的CarE活性显著提升^［27］；化丽丹等研究报道经蓖麻碱处理的甜菜夜蛾幼虫，其体内的ACP和ALP活性均受到显著抑制^［28］；朱春亚等发现，苦瓜叶乙酸乙酯萃取物能够显著抑制ACP和ALP的活性，对CarE活性的影响表现为抑制、诱导、再恢复^［29］。本研究結果显示，黏虫幼虫经黄帚橐吾乙醇提取物处理后，体内的CarE、ACP和ALP活性整体呈现被抑制的趋势，说明该药物可能通过降低上述3种酯酶的活性，造成黏虫对外源刺激物的代谢阻滞，从而延长了药物在黏虫体内的作用时间，给黏虫带来了相对更大的伤害。

本研究中，48 h内黏虫幼虫经高于半致死浓度的药物处理，即处理浓度在5.0 mg/mL及以上时，试虫的校正死亡率均大于50%，此现象与试虫体内代谢酶系的变化相吻合。

黄帚橐吾乙醇提取物处理黏虫后对代谢酶系均有一定的影响，这表明黄帚橐吾乙醇提取物的生物农药活性与多种代谢酶的变化有关，本研究探讨了蛋白水平上各种代谢关键酶活性对药物的反应，而调控这些酶活性的分子机制还有待进一步深入探究。

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