微生物饲料添加剂屎肠球菌质量安全分析

郭玉翠 韩镌竹 邱月 高铎 李欣南

【摘要】探讨饲用屎肠球菌生物安全性评价方法，初步掌握市售屎肠球菌生物安全现状。采用生化鉴定技术、PCR技术、药敏检测分析等方法，对市售10个生产企业的屎肠球菌开展质粒筛查、溶血分析、耐药性检测和毒力分析。结果显示10株屎肠球菌均不含有质粒，也不存在溶血反应。对监测的27种药物中苯唑西林、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异恶唑的耐药率较高，分别为70%、60%、80%和60%，其余药物均敏感。耐药基因检测结果与药敏结果基本一致。毒力基因结果显示屎肠球菌均携带毒力基因gelE、asal、esp，均不携带毒力基因ace，优势组合为gelE+asal+esp+ccf。屎肠球菌的耐药机制和毒力基因存在情况较为复杂，潜在细胞黏附和细胞毒性侵袭风险，急需建立饲用屎肠球菌的生物安全性的监测手段和评价标准。

【关键词】屎肠球菌；耐药性；毒力基因；饲料添加剂；安全性评价

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.01.028

【基金项目】辽宁省自然科学基金项目（2019-ZD-0845）。

Quality and Safety Analysis of Microbial Feed Additive Enterococcus Faecium

GUO Yu-cui，HAN Juan-zhu，QIU Yue，GAO Duo，LI Xin-nan

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China）

Abstract：To explore the biosafety evaluation method of feeding Enterococcus faecium，and preliminarily grasp the biosafety status of Enterococcus faecium in the market. Plasmid screening，hemolysis analysis，drug resistance detection and virulence analysis of Enterococcus faecium from 10 commercial enterprises were carried out by means of biochemical identification technology，PCR technology and drug sensitivity detection and analysis. The results showed that none of the 10 strains of Enterococcus faecium contained plasmid and hemolytic reaction. Among the 27 drugs monitored，the drug resistance rates of oxacillin，clindamycin，tylosin and sulfaisoxazole were 70%，60%，80% and 60% respectively. The other drugs were sensitive. The results of drug resistance gene detection were basically consistent with the results of drug sensitivity. The results of virulence gene showed that Enterococcus faecium carried virulence genes gelE，asal and esp，and none carried virulence gene ace. The dominant combination was gelE+asal+esp+ccf. The drug resistance mechanism and virulence genes of Enterococcus faecium are complex， and there is a potential risk of cell adhesion and cytotoxic invasion. It is urgent to establish the monitoring means and evaluation criteria for the biosafety of feeding Enterococcus faecium.

Key words：Enterococcus faecium；drug resistance；virulence gene；feed additive；safety evaluation

屎肠球菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，属于肠球菌属[1]。2013年我国农业农村部发布的《饲料添加剂品种目录》，将屎肠球菌列为允许使用的饲用菌种之一[2]，广泛应用于畜禽養殖。研究表明屎肠球菌有助于帮助机体消化和肠道代谢，从而增强动物免疫能力，促进动物生长，提高饲料转化率[3-4]。但它也是一种条件性致病菌，常引起人和动物尿路感染等疾病，其耐药性产生与传递会造成动物整体耐药水平的提高，增加患病动物的临床治疗难度[5-7]。近些年，市售含屎肠球菌的饲料添加剂产品越来越多，其安全性和稳定性也引起了相关管理部门的高度重视[8-9]。本文对10株饲用屎肠球菌开展了27种药物耐药性分析，并对6种肠球菌关键毒力基因分布情况进行了系统分析，以期为该类产品的安全性评价提供数据依据。

1材料与方法

1.1菌株及样品来源

质控菌株粪肠球菌ATCC 29212中国兽医药品监察所赠送；屎肠球菌饲料添加剂样品市售。

1.2培养基与试剂

粪肠球菌琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司）；哥伦比亚血琼脂基础（北京路桥生物科技股份有限公司）；革兰氏阳性鉴定卡（梅里埃诊断产品有限公司）；革兰氏阳性药物敏感性测定板（上海星佰生物技术有限公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司）；2×Taq PCR MasterMix、DL1000、琼脂糖（大连宝生物工程有限公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3仪器设备

Nu-425-400S生物安全柜（美国NUAIRE公司）；GR85DA高压蒸汽灭菌器（美国ZEALWAY）；恒温培养箱（德国BINDER公司）；VITEK2 Compact细菌鉴定及药敏分析仪（BIOMERIEUX公司）；430-A全自动菌液接种仪（美国Sensititve）、ULTI1386-3-V41超低温冰柜（美国THERMO公司）；CF16RN高速低温冷冻离心机（日本HITACHI）；TC-512PCR仪（北京德力莱）；DYY-6C型电泳仪（北京六一）；170-8170型紫外凝胶成像系统（美国BIO-RAD）。

1.4方法

1.4.1细菌鉴定

样品溶解于0.9%无菌生理盐水中，经梯度稀释后涂布于粪肠球菌琼脂培养基上，控制平板上菌落数在30～300范围内，倒置于37℃培养箱培养48 h[10-11]，选取疑似菌落接种于哥伦比亚血琼脂基础培养基上，倒置于37℃培养箱培养24 h，分离获得的细菌进行细菌生化鉴定。

1.4.2药敏试验

药敏试验采用肉汤稀释法。取新鲜培养物使用无菌生理盐水调节菌液浓度至0.5麦氏，再做200倍稀释获得菌悬液，使用全自动菌液接种仪加样，药敏板置于37℃恒温培养箱培养16～18 h，药敏试验结果依据美国临床实验室标准协会（CLSI）标准判读[12]。

1.4.3質粒提取

采用质粒提取试剂盒对屎肠球菌进行质粒DNA提取，琼脂糖凝胶的浓度为1.0%，质粒DNA的上样体积为10μL，电压 110 V，电泳时间30 min。

1.4.4溶血试验

采用脱纤维绵羊血制备哥伦比亚血琼脂，将试验菌株涂布于血琼脂平板上，37℃恒温培养箱培养16～18 h。

1.4.5毒力基因和耐药基因的PCR检测

采用细菌基因组DNA提取试剂盒对屎肠球菌进行基因组提取，作为PCR模板，模板浓度A260/A280均在1.8～2.0之间。6种肠球菌关键毒力基因别为明胶酶E（gelatinase，gelE）、聚集物质（aggregation substance，asal）、胶原蛋白黏附素（collagen-binding-adesin of Enterococcal，ace）、表面蛋白（enterococcal surface protein，esp）、溶血素（cytolysin，cylA）、性信息素（sex pheromone，ccf），引物的设计参照文献[13-14]方法。毒力基因引物信息详见表1。

12种肠球菌耐药基因分别为氨基糖苷类耐药基因Aac（6）/aph（2）、aph（3）-Ⅲ、ant（4-4）；四环素类耐药基因tetA、tetC、tetM；β-内酰胺类耐药基因blaTEM、blaCTX-M；糖肽类耐药基因VanA、VanB；噁唑烷酮类耐药基因optrA；红霉素耐药基因ermB，引物的设计参照文献[15-16]方法，引物序列见表2。PCR反应体系为50μL体积，PCR Mix25μL，上、下游引物各0.5μL（10μM），DNA模板液1.5μL，双重蒸馏水22.5μL。PCR扩增条件为95℃预变性4 min；94℃变性1 min，55℃退火60 s（其中cylA退火温度为60℃），72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶的浓度为1.5%，PCR扩增产物的上样体积为10μL，电压110 V，电泳时间30 min。

2结果与分析

2.1细菌分离鉴定结果

分离获得饲用屎肠球菌10株。分离株在粪肠球菌琼脂培养基上为砖红色菌落，边缘光滑，结果见图1。在5%哥伦比亚血琼脂基础上为灰白色菌落，表面晶莹，边缘光滑，结果见图2。采用细菌检定仪进行屎肠球菌生化鉴定，鉴定百分率（ID%）达99%，详细结果见表3。

2.2药敏试验结果

对10株屎肠球菌开展了27种抗菌素的药敏试验，其中19种在CLSI上给出了判定标准。药敏结果显示屎肠球菌对阿莫西林/克拉维酸、青霉素、复方新诺明、万古霉素、替米考星、红霉素、氟苯尼考、四环素、强力霉素（多西霉素）、利奈唑胺均敏感，耐药率为0%；对庆大霉素、头孢噻呋、恩诺沙星、氧氟沙星轻度耐药，耐药率分别为10%、10%、20%、10%；对苯唑西林、克林霉素、泰妙菌素、磺胺异恶唑的耐药率较高，分别为70%、60%、80%和60%；对头孢西丁的耐药率达100%，而肠球菌对头孢菌素、苯唑西林、单环类等抗生素天然耐药，所以头孢西丁耐药率会达到100%。

其余抗生素属于促生长抗生素，主要考察此类抗生素的MIC范围，经试验发现杆菌肽的MIC值介于4～64μg/mL之间；吉他霉素MIC值介于0.5～8μg/mL之间；阿维拉霉素MIC值介于0.5～16μg/mL之间，那西肽MIC值介于0.015～0.06μg/ mL之间，维吉尼亚霉素MIC值介于0.25～1μg/mL之间；黄霉素MIC值在16μg/mL以上；喹烯酮MIC值均>64μg/mL；同时，对恩拉霉素药敏结果差异较大，部分细菌药敏结果≤0.25μg/mL，部分>64μg/mL。

2.3质粒测定结果

10株屎肠球菌均不携带质粒，具体结果见图3。

2.4溶血试验结果

10株屎肠球菌均不溶血，具体结果见图4。

2.5毒力基因结果分析

通过对6种肠球菌关键毒力基因的检测发现10株屎肠球菌均携带明胶酶gelE、聚集物质asal、表面蛋白esp毒力基因，携带率为100%；其次为ccf，携带率为60%；对毒力基因cylA的携带率为10%；10株屎肠球菌均不携带毒力基因ace。10株屎肠球菌毒力基因优势组合为gelE+asal+esp+ccf，详见表4。

2.6耐药基因结果分析

通过对12种肠球菌耐药基因的检测发现10株屎肠球菌均携带tetC，携带率为100%；其次为Aac（6）/aph（2）和blaCTX-M，携带率分别为90%和50%；对耐药基因tetA和blaTEM的携带率为10%；10株屎肠球菌均不携带耐药基因aph（3）-Ⅲ、ant（4-4）、tetM、VanA、VanB、optrA、ermB，具体结果详见表5。耐药基因检测结果与药敏结果基本一致。以样品4为例，耐药基因检测结果见图5。

3討论

细菌耐药性是阻碍兽医临床治疗的关键问题，而大量饲用微生物的使用则潜在耐药性流行与传播的风险。目前，屎肠球菌虽然作为饲用益生菌大量应用于养殖业中，但我们仍要关注其毒力与抗性的突变。本研究结果表明监测的饲用屎肠球菌未检测到VRE耐药表型，利奈唑胺均敏感。对头孢西丁的耐药率达100%，是屎肠球菌的天然的抗性，这与相关报道一致[17]。此外，国内外学者研究发现肠球菌属毒力基因esp和ace与生物被膜的形成具有密切相关性，而asal、cylA、gelE和ccf则与细胞毒性密切相关[18-20]。本研究中发现监测的屎肠球菌均不携带ace，均携带gelE、asal和esp毒力基因，存在多种毒力基因组合，其优势组合为gelE+asal+esp+ccf，说明监测的屎肠球菌毒力基因存在情况较为复杂，潜在细胞黏附和细胞毒性侵袭风险。当前我国饲用微生物均是通过安全性评价和审批后投入生产，但上市后的监管仍然滞后。饲用微生物的安全使用需要更多的监测手段和方法，急需建立饲用肠球菌安全性评价的标准，这对于保障养殖业健康发展与公共卫生安全具有重要意义。

4结论

屎肠球菌的耐药机制和毒力基因存在情况较为复杂，潜在细胞黏附和细胞毒性侵袭风险，急需建立使用中的饲用屎肠球菌的生物安全性的监测手段和评价标准。

【参考文献】

[1]王曈，万佳宏，常佳伟，等.宁夏地区牛源肠球菌分离鉴定及耐药性与毒力基因检测[J].中国兽医学报，2020，40（3）：562-567.

[2]韩明渠，李富伟，吴培均.一株猪源屎肠球菌的分离鉴定及系统进化分析[J].饲料博览，2018（4）：32-35+43.

[3]王永，杨维仁.屎肠球菌对断奶仔猪生产性能、免疫功能的影响[C]//.中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会论文集，2012：96.

[4]容庭，何前，陈庄，等.屎肠球菌及其在仔猪生产上的研究现状[J].饲料工业，2008，29（22）：55-57.

[5]葛龙，李波.屎肠球菌在饲用微生态制剂中的研究与应用[J].饲料与畜牧，2013（6）：57-59.

[6]白耀霞，任建元.70株临床分离肠球菌的毒力基因检测与耐药性分析[J].中国医药科学，2020，10（3）：153-157.

[7]汪娟，答嵘，程悦，等.屎肠球菌临床分离株的耐药性及生物膜形成与毒力因子的相关性分析[J].西安交通大学学报（医学版），2020，41（1）：135-140+149.

[8]王黎文.欧洲食品安全局动物饲料添加剂和饲料产品委员会关于动物营养中屎肠球菌的安全性评估指南[J].中国饲料，2014（15）：37-40.

[9]姜芹，孙冰清，张文刚，等.市售4种屎肠球菌饲料添加剂的质量分析[J].饲料研究，2017（21）：1-3.

[10]武凤娇，韩镌竹，高铎，等.饲料微生态产品中粪肠球菌含量检测方法的建立[J].现代畜牧兽医，2018（9）：14-19.

[11]韩镌竹，李欣南，苏葳艺，等.两种粪肠球菌的分离方法比较[J].现代畜牧兽医，2015（1）：5-9.

[12] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Refer-enceMethodforBrothDilutionAntifungal Susceptibility Test-ing of Conidium-forming Filamentous Fungi[M]. ApprovedStandard M38 A. PA，USA：Wayne，2002.

[13] COMERLATO C B，CARVALHO DE RESENDE M C，CAIERO J，et al. Presence of virulence factors in EnterococcusfaecalisandEnterococcusfaecium susceptible and resistant to vancomycin[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz，Rio de Janeiro，2013，108（5）：590-595.

[14] DRAHOVSKA H，SLOBODNIKOVA L，KOCINCOVA D，et al. Antibiotic resistance and virulence factorsamong clinical and food Enterococci isolated in Slovakia[J].Folia Microbiol，2004，49（6）：763-768.

[15]宋超慧，轩慧勇，吾买尔江·牙合甫，等.乌鲁木齐市宠物源粪肠球菌和屎肠球菌耐药性及耐药基因检测[J].动物医学进展，2012，42（8）：57-63.

[16] Hoban D J，Wierzbowski A K，Nichol K，et al.MacrolideResistant Streptococcus pneumoniae in Canada during 1998–1999：Prevalenceofmef（A）anderm（B）and SusceptibilitiestoKetolides[J].AntimicrobAgents Chemother，2001，45（7）：2147-2150.

[17]肖何，张艳，王永瑞，等.新疆西北地区原奶和手工奶酪中屎肠球菌耐药性及毒力基因分析[J].微生物学杂志，2019，39（1）：37-43.

[18]宋娟，华川.临床感染粪肠球菌致病岛毒力相关基因的研究现状[J].西南军医，2015，17（4）：422-425.

[19]王佳慧，贾丹，李贺海，等.屎肠球菌携带毒力基因及其耐药性检测[J].中国兽医科学，2020，50（11）：1428-1432.

[20]鲁旭，田万红，张影，等.一株益生性粪肠球菌的安全性评价[J].中国微生态学杂志，2020，32（7）：750-757+763.

【作者簡介】

郭玉翠，女，1994年出生，助理畜牧师，学士，研究方向为功能型微生物、养殖投入品与食品质量安全检测技术。

通讯作者：李欣南，女，1978年出生，正高级畜牧师，博士，研究方向为功能型微生物、动物源细菌耐药性、养殖投入品与食品质量安全检测技术。E-mail：lixinnanli@163.com，手机号码：13840472601。

（编辑：李加鹏）