AHP-熵权法结合Box-Behnken设计-响应面法优选黄精酒制工艺及其炮制前后药效对比研究

石双慧，王梦琳，魏晓彤，马思媛，胡宇峰，张婧秋，王慧楠，陈梦雨，刘芊芊，王英姿

AHP-熵权法结合Box-Behnken设计-响应面法优选黄精酒制工艺及其炮制前后药效对比研究

石双慧，王梦琳，魏晓彤，马思媛，胡宇峰，张婧秋，王慧楠，陈梦雨，刘芊芊，王英姿*

北京中医药大学中药学院，北京 102488

优化酒黄精wine-processed的高压蒸制工艺，确定最佳工艺参数，并对酒制前后刺激性、免疫调节及降血糖作用进行研究。以润制时间、蒸制压力、蒸制时间和焖制时间作为考察因素，以性状、黄精多糖、薯蓣皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）作为考察指标，运用AHP-熵权法结合Box-Behnken设计-响应面法（Box Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）确定酒黄精炮制工艺条件参数。通过家兔眼刺激性实验，评价黄精酒制前后的刺激性作用。通过ip环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，比较黄精酒制前后对免疫调节作用的影响。通过饲喂高脂高糖饲料、ip链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型，比较黄精酒制前后对降血糖作用的影响。酒黄精炮制最佳工艺参数为润制时间5 h、蒸制时间1 h、蒸制压力0.06 MPa、焖制时间7 h。药效实验结果表明，生黄精具有刺激性，黄精酒制后对黏膜的刺激作用减弱，酒黄精提高小鼠免疫力和降血糖的作用均强于生黄精。优选出的酒黄精炮制工艺稳定、合理、可行，按照此工艺制备的酒黄精，可以降低其刺激性，增强免疫调节作用和降血糖作用，为黄精的炮制工艺研究和临床用药提供参考。

AHP-熵权法；Box-Behnken设计-响应面法；酒黄精；炮制工艺；刺激性；免疫调节；降血糖作用；薯蓣皂苷元；5-羟甲基糠醛

黄精为百合科黄精属植物滇黄精Coll. et Hemsl.、黄精Red.或多花黄精Hua的干燥根茎，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效[1]。黄精生品直接服用刺人咽喉，酒制可去除其刺激性，增强补脾润肺、益肾的功效[2-5]。《中国药典》2020年版黄精项下收录了酒黄精饮片，但对于其具体炮制参数描述均较为笼统，而且目前各地炮制标准对于酒黄精的炮制工艺不统一，影响临床疗效，因此，建立符合《中国药典》规范及临床要求的酒黄精饮片的炮制工艺非常必要。

现代研究表明，与常压蒸制相比，酒黄精高压蒸制不仅便于控制温度、时间等影响因素，极大地缩短炮制时间，同时还可以减少活性成分的流失，增强疗效[6-8]。多糖在黄精中含量最高，是《中国药典》2020年版规定的评价黄精质量的重要指标，也是黄精发挥免疫调节作用最重要最主要的功能性成分。皂苷是黄精中另一主要药效成分，目前，对皂苷类成分的研究主要集中于薯蓣皂苷元[9-12]。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）是黄精炮制过程中的副产物，既有药理活性又有毒理性[13-16]。黄精炮制后的外观性状常作为传统鉴别手段，浸出物体现了药材整体含量水平。因此，本实验对酒黄精的炮制工艺研究过程中，以湖南产多花黄精为研究对象，选择性状、黄精多糖、薯蓣皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF为质量控制指标，首先采用单因素法优选酒黄精饮片炮制工艺，再采用层次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵权法结合Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM）优选多花黄精高压蒸制工艺参数并进行验证，同时对黄精酒制前后的刺激性、免疫调节作用和降血糖作用进行研究，为建立稳定可控的酒黄精饮片炮制工艺提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BSI10S型万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；YX-280D型数显手提式灭菌器，容积18 L，合肥华泰医疗设备有限公司；QM-Q5-Y30DW型电蒸锅，长沙市全民电器有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱，北京北方利辉实验仪器设备有限公司；KH7200DB型数控超声波清洗机，昆山禾创超声仪器有限公司；UltiMate 3000型高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；756PC型紫外-可见分光光度计，舜宇恒平科学仪器有限公司；HW.SY21-KP6型智能恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司；ZN-02型粉碎机，北京兴时利和科技发展有限公司；A015型多功能酶标仪，Molecular Devices；XN-1000V[B1]型血液系统分析仪，德国赛多利斯（北京）仪器有限公司；ACCU-CHEK型血糖仪，德国Roche公司；AU680型自动生化分析仪，美国Beckman Coulter公司。

1.2 材料

黄精药材，批号2020042401，购于新邵南陌生物科技有限公司，经北京中医药大学刘春生教授鉴定，植物基原为百合科黄精属植物多花黄精Hua的干燥根茎，验证试验3批药材批号分别为2020042402、2020042403、2020042404。黄酒，批号20180812，酒精度≥15.5% vol，购自会稽山绍兴酒股份有限公司。

对照品薯蓣皂苷元（批号C10J9Q52616，HPLC测定质量分数≥98%）、无水葡萄糖（批号S22J12H137237，质量分数≥98%）、5-HMF（批号Z25N8B49010，HPLC测定质量分数≥98%）及试剂环磷酰胺（批号X13J11Y115691）、盐酸左旋咪唑（批号Y23M9C56327）、印度墨水（批号L17S11G124902）、链脲佐菌素（批号S17049）、二甲双胍（批号B15A11D121557）、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（批号S30GR162949），均购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数均≥98%。氯化钠注射液，批号2007091901，购自石家庄四药有限公司。无水碳酸钠（批号20191019）、盐酸（批号20190426），均分析纯，购自北京化工厂。乙腈（批号164793）、甲醇（批号165503），均为色谱级，购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 动物

健康雄性新西兰兔6只，体质量2.0～2.5 kg，由中国食品药品检定研究院提供，动物许可证号SYXK（京）2017-0005，适应性饲养3 d后进行试验。SPF级健康BALB/c系小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g，购自斯贝福北京动物科技有限公司，动物许可证号SYXK（京）2020-0033，适应性喂养7 d后开始实验。SPF级健康雄性C57BL/6系小鼠，体质量（20±2）g，购自斯贝福北京动物科技有限公司，动物许可证号SYXK（京）2020-0033。本研究通过北京中医药大学实验动物伦理委员会的批准，批准号BUCM-4-2022092704-3106。

2 方法与结果

2.1 酒黄精炮制工艺

取100 g黄精原药材，加20 g黄酒拌匀（黄酒用量按照《中国药典》2020年版[1]黄精项下酒黄精饮片，“每100 kg黄精，用黄酒20 kg”），润制一定时间，置于高压灭菌器中在一定蒸制压力下蒸制一定时间后，常压焖制一定时间，稍晾，切厚片（2～4 mm），60 ℃鼓风干燥，即得酒黄精饮片。

2.2 黄精多糖含量测定

依据《中国药典》2020年版一部黄精项下黄精多糖测定方法进行测定[1]。

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取无水葡萄糖对照品适量，加水溶解，配制成质量浓度为0.33 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取黄精不同炮制品细粉0.25 g，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，合并滤液与洗液，放冷，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置10 mL具塞刻度试管中，各加水至2.0 mL，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10 min，取出，立即置冰水浴中冷却10 min，取出，以相应试剂为空白，测定待测溶液的吸光度（）值。以值为纵坐标（），质量浓度为横坐标（），绘制标准曲线，进行线性回归，得到无水葡萄糖对照品线性回归方程为＝0.007 5＋0.045 7，2＝0.999 5。结果表明，无水葡萄糖在16.50～99.20 μg/mL与值呈良好的线性关系。

2.2.4 样品测定 精密称取黄精不同炮制品粉末，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，按照“2.2.3”项下方法测定值，根据标准曲线计算供试品溶液中多糖含量。

2.3 薯蓣皂苷元的含量测定[17-21]

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取薯蓣皂苷元对照品适量，加甲醇溶解，配制成质量浓度为0.41 mg/mL的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取过4号筛的黄精不同炮制品粉末2 g，置于锥形瓶中，加50 mL无水乙醇，称定质量，水浴回流提取4 h，放置室温后再次称定质量，用无水乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过。取续滤液20 mL，旋干，残渣加3 mol/L的盐酸溶液80 mL，沸水浴水解4 h，冷却后分别用20、10、10 mL石油醚萃取3次，合并萃取液，加20 mL水洗涤2次，减压浓缩后留取残渣，加甲醇溶解定容至1 mL量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3.3 色谱条件 色谱柱为GL Science Incnsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为乙腈-水（94∶6）；检测波长203 nm；体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 µL。对照品和样品的色谱图见图1。

2.3.4 线性关系考察 取“2.3.1”项下薯蓣皂苷元对照品，稀释成不同质量浓度梯度的系列对照品溶液，按照“2.3.3”项下色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标（），质量浓度为横坐标（），绘制标准曲线，进行线性回归，得薯蓣皂苷元线性回归方程为＝3.738 4＋23.256 0，2＝0.999 3，结果表明薯蓣皂苷元在1.71～16.80 μg/mL与峰面积积分值线性关系良好。

2.3.5 精密度考察 取“2.3.1”项下薯蓣皂苷元对照品溶液，按照“2.3.3”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算其RSD值为0.75%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性考察 精密称定BBD-RSM试验第19号酒黄精样品粉末6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下色谱条件测定峰面积，计算薯蓣皂苷元质量分数的RSD值为2.10%，重复性良好。

2.3.7 稳定性考察 精密称定BBD-RSM试验第19号酒黄精样品粉末，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下色谱条件分别在制备后0、2、4、6、8、10、12 h进样，测定峰面积，计算其RSD值为1.81%，表明供试品溶液在12 h内具备良好的稳定性。

2.3.8 加样回收率考察 取已测知薯蓣皂苷元含量的BBD-RSM试验第19号酒黄精样品粉末，精密称定，共6份，根据样品中薯蓣皂苷元的含量，按1∶1的比例加入薯蓣皂苷元对照品，按“2.3.2”项下方法操作，制备6份供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果平均加样回收率为98.45%，RSD值为2.42%，表明该方法加样回收率符合规定。

2.3.9 样品测定 精密称取黄精不同炮制品粉末，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下色谱条件测定各样品中薯蓣皂苷元的含量。

2.4 5-HMF的含量测定[22-24]

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取5-HMF对照品适量，用50%甲醇溶解并稀释，制得质量浓度为0.40 mg/mL的对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 精密称取过3号筛的黄精不同炮制品粉末1 g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，在100 W、50 kHz的超声条件下提取25 min，取出放凉，用50%甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4.3 色谱条件 色谱柱为Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（10∶90）；检测波长285 nm；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。色谱图见图2。

2.4.4 线性关系考察 精密吸取“2.4.1”项下对照品溶液，稀释成不同质量浓度梯度的系列对照品溶液，按照“2.4.3”项下色谱条件分别测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标（），质量浓度为横坐标（），绘制标准曲线，进行线性回归，所得线性回归方程为＝1 220.68－1.50，2＝0.999 4，结果表明5-HMF在0.02～0.40 mg/mL内进样量与峰面积呈良好的线性关系。

图2 5-HMF对照品(A)及酒黄精样品(BBD-RSM试验第19号, B)的HPLC图

2.4.5 精密度考察 取“2.4.1”项下的5-HMF对照品溶液，按照“2.4.3”项下色谱条件操作，连续进样6次，测定5-HMF峰面积，计算得其RSD值为1.63%，结果表明仪器精密度良好。

2.4.6 重复性考察 精密称定BBD-RSM试验第19号酒黄精样品粉末6份，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4.3”项下色谱条件测定峰面积，计算得5-HMF质量分数的RSD值为1.61%，色谱条件重复性良好。

2.4.7 稳定性考察 精密称定BBD-RSM试验第19号酒黄精样品粉末，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4.3”项下色谱条件分别在制备后0、2、4、6、8、10、12 h进样，测定峰面积，计算其RSD值为1.65%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.8 加样回收率考察 取已测知5-HMF含量的BBD-RSM试验第19号酒黄精样品，精密称定，共6份，根据样品中5-HMF的含量，按1∶1的比例加入5-HMF对照品，按“2.4.2”项下方法操作，制备6份供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件测定，计算得5-HMF的平均加样回收率为98.770%，RSD值为1.82%，方法加样回收率良好。

2.4.9 样品测定 精密称取黄精不同炮制品粉末，按照“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.4.3”项下色谱条件测定各样品中5-HMF的含量。

2.5 浸出物的含量测定

参照《中国药典》2020年版[1]浸出物测定法（通则2201）中的热浸法，测定水溶性浸出物及醇溶性浸出物含量。

2.6 酒黄精炮制工艺的单因素试验

酒制法是黄精的传统炮制方法，也是现行药典中规定的炮制方法。《中国药典》2020年版收载的酒黄精炮制方法为“每100 kg黄精，用黄酒20 kg，照酒炖法或酒蒸法炖透或蒸透，稍晾，切厚片，干燥”[1]，但具体参数缺乏量化指标。研究发现，润制时间、蒸制压力、蒸制时间、焖制时间等因素均对酒黄精的质量产生一定影响[5-7,25]。因此，本实验选择润制时间、蒸制压力、蒸制时间、焖制时间作为酒黄精炮制工艺的考察因素，以酒黄精性状以及黄精多糖、薯蓣皂苷元、水溶性浸出物、醇溶性浸出物和5-HMF含量作为评价指标，进行单因素考察研究。

2.6.1 不同润制时间考察 称取黄精原药材4份，每份100 g，在20%的加黄酒量下分别润制3、4、5、6 h，置于高压蒸汽灭菌锅中，在0.04 MPa压力下，蒸制2 h，焖制8 h。按照《中国药典》2020年版酒黄精饮片性状项下规定：“表面棕褐色至黑色，有光泽，中心棕色至浅褐色，可见筋脉小点，质较柔软。味甜，微有酒香气”[1]，进行性状鉴别，并依次测定黄精多糖、薯蓣皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量，结果见表1。润制时间为4 h时，酒黄精饮片性状与《中国药典》2020年版描述一致，黄精多糖、薯蓣皂苷元含量最高，因此，在进行后续BBD-RSM设计时，选择4 h作为润制时间的中心点。

表1 不同润制时间对酒黄精性状和评价指标含量的影响(, n = 3)

2.6.2 不同蒸制压力考察 称取黄精原药材4份，每份100 g，在20%的加黄酒量下润制4 h，置于高压蒸汽灭菌锅中，分别在0.02、0.04、0.06、0.08 MPa压力下，蒸制2 h，焖制8 h，进行性状鉴别，并依次测定黄精多糖、薯蓣皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量，结果见表2。蒸制压力为0.04 MPa时，酒黄精饮片性状与《中国药典》2020年版描述一致，黄精多糖最高，薯蓣皂苷元、醇浸出物和水浸出物较高。因此，在进行后续BBD-RSM设计时，选择0.04 MPa作为蒸制压力的中心点。

2.6.3 不同蒸制时间考察 称取黄精原药材4份，每份100 g，在20%的加黄酒量下润制4 h，置于高压蒸汽灭菌锅中，在0.04 MPa压力下，分别蒸制1、2、3、4 h，焖制8 h，进行性状鉴别，并依次测定黄精多糖、薯蓣皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量，结果见表3。蒸制时间为2 h时，酒黄精饮片性状与《中国药典》2020年版描述一致，薯蓣皂苷元、水浸出物最高，黄精多糖、醇浸出物较高。因此，选择2 h为后续BBD-RSM设计中蒸制时间的中心点。

2.6.4 焖制时间考察 称取黄精原药材4份，每份100 g，在20%的加黄酒量下润制4 h，置于高压蒸汽灭菌锅中，在0.04 MPa压力下，蒸制2 h，分别焖制7、8、9、10 h，进行性状鉴别，并依次测定黄精多糖、薯蓣皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量，结果见表4。结果表明，焖制时间为8 h时，酒黄精饮片性状与《中国药典》2020年版描述一致，黄精多糖、醇浸出物含量最高，水浸出物和薯蓣皂苷元较高。因此，选择8 h为后续BBD-RSM设计中焖制时间的中心点。

表2 不同蒸制压力对酒黄精性状和评价指标含量的影响(, n = 3)

表3 不同蒸制时间对酒黄精性状和评价指标含量的影响(, n = 3)

2.7 基于AHP-熵权法结合BBD-RSM法优化酒黄精炮制工艺

2.7.1 AHP法计算各评价指标的权重系数[26-27]本实验以黄精多糖、醇溶性浸出物、水溶性浸出物、5-HMF、薯蓣皂苷元含量为评价指标，根据影响酒黄精指标间的相互关系及重要程度，确定各指标先后顺序：黄精多糖＞醇浸出物＝水浸出物＞5-HMF＞薯蓣皂苷元。采用1-9标度法构成评价指标两两比较的优先矩阵，并计算各指标权重系数（W1），结果见表5。

2.7.2 AHP-熵权法计算复合权重[26,28-29]根据熵权法公式计算权重系数（W2），醇浸出物、水浸出物、黄精多糖、薯蓣皂苷元、5-HMF的权重系数W2分别为0.131 7、0.152 4、0.175 0、0.374 9、0.166 0。根据公式计算复合权重W，醇浸出物、水浸出物、黄精多糖、薯蓣皂苷元、5-HMF的复合权重W依次为0.156 3、0.181 0、0.415 7、0.148 4、0.098 6。

表4 不同焖制时间对酒黄精性状和评价指标含量的影响(, n = 3)

表5 指标成对比较的判断优先矩阵

Table 5 Decision matrix of paired comparison on indexes

权重指标醇浸出物水浸出物黄精多糖薯蓣皂苷元5-HMFWj1 醇浸出物111/2320.21 水浸出物111/2320.21 黄精多糖221640.41 薯蓣皂苷元1/31/31/612/30.07 5-HMF1/21/21/43/210.10

2.7.3 综合评分计算[26,30-31]按公式计算酒黄精各指标成分的综合评分。

X为各指标含量，Xmax为各指标含量最大值

2.7.4 BBD-RSM试验设计及结果 根据单因素试验考察结果，选择润制时间（1）、蒸制时间（2）、蒸制压力（3）和焖制时间（4）4个因素为自变量，以黄精多糖、薯蓣皂苷元、水浸出物、醇浸出物和5-HMF含量综合评分为因变量，采用4因素3水平的BBD-RSM设计方法，考察各因素对酒黄精炮制工艺的影响。每个因素设置高、中、低3个水平，分别记作−1、0、+1，利用Design-Expert 11软件进行多元回归拟合，BBD-RSM因素水平、试验设计及结果见表6。

表6 BBD-RSM因素水平、试验设计及结果

Table 6 Level of factors, test design and results of BBD-RSM

序号X1/hX2/hX3/MPaX4/h醇浸出物/%水浸出物/%黄精多糖/(mg∙g−1)薯蓣皂苷元/(μg∙g−1)5-HMF/(mg∙g−1)综合评分 15 (+1)2 (0)0.04 (0)9 (+1)62.3961.7226.2518.601.0355.18 24 (0)3 (+1)0.04 (0)7 (−1)70.3067.9518.7718.301.4156.09 33 (−1)1 (−1)0.04 (0)8 (0)67.5066.4938.539.780.5057.37 45 (+1)3 (+1)0.04 (0)8 (0)68.3966.4842.7510.130.3358.78 54 (0)2 (0)0.02 (−1)9 (+1)62.3758.5947.5116.140.3760.76 64 (0)1 (−1)0.04 (0)9 (+1)59.2157.1650.8416.050.4161.61 74 (0)2 (0)0.06 (+1)9 (+1)62.0360.1746.8015.680.5261.63 85 (+1)2 (0)0.02 (−1)8 (0)53.4755.5751.8915.121.0661.93 94 (0)3 (+1)0.06 (+1)8 (0)55.9254.1653.2414.720.8761.94 104 (0)1 (−1)0.02 (−1)8 (0)67.6663.2747.1213.630.4062.00 113 (−1)2 (0)0.04 (0)7 (−1)62.0561.4136.8216.442.4763.22 125 (+1)2 (0)0.06 (+1)8 (0)59.6060.6549.6217.090.6363.22 133 (−1)2 (0)0.04 (0)9 (+1)44.7449.2163.2115.081.1163.74 145 (+1)2 (0)0.04 (0)7 (−1)60.9859.7048.1715.421.6665.01 154 (0)2 (0)0.02 (−1)7 (−1)64.0063.0760.2810.690.3965.82 163 (−1)2 (0)0.06 (+1)8 (0)59.4866.3865.149.410.3267.06 174 (0)3 (+1)0.04 (0)9 (+1)66.8469.0050.2524.690.6571.26 184 (0)2 (0)0.06 (+1)7 (−1)65.6463.2370.788.671.0172.05 194 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)56.5058.3061.4619.402.0172.82 205 (+1)1 (−1)0.04 (0)8 (0)63.3660.9060.7321.601.0272.88 213 (−1)3 (+1)0.04 (0)8 (0)56.1858.7061.2019.592.0273.27 223 (−1)2 (0)0.02 (−1)8 (0)56.0858.2861.2020.522.0073.57 234 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)67.5765.4955.9228.890.1573.72 244 (0)1 (−1)0.06 (+1)8 (0)55.5560.8460.8420.612.0774.19 254 (0)3 (+1)0.02 (−1)8 (0)56.0859.2861.0921.592.0474.41 264 (0)1 (−1)0.04 (0)7 (−1)65.4966.1372.4116.650.5076.02 274 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)59.2956.8865.2415.053.1276.31 284 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)66.7566.1075.7510.231.0976.40 294 (0)2 (0)0.04 (0)8 (0)64.9163.1288.4921.491.1386.68

2.7.5 模型拟合 采用Design Expert 11软件对比各模型拟合参数，建立醇浸出物、水浸出物、黄精多糖、薯蓣皂苷元和5-HMF的综合评分（）对润制时间（1）、蒸制时间（2）、蒸制压力（3）和焖制时间（4）的二次回归模型方程：＝77.19－1.771－0.692＋0.133－2.004－7.5012＋1.9513－2.5914－6.1723＋7.3924－1.3434－7.2312－4.1622－4.3132－7.5942，二项式拟合方程的2＝0.852 1，＝0.001 2＜0.01，失拟项＝0.902 2＞0.05，表明二次多项式回归模型拟合度较高，可靠性较强。因此，选用该模型对酒黄精炮制工艺进行预测和分析具有一定的合理性和可行性。该回归模型中12、23、24、12、42项的＜0.01，表明因素1与因素4对综合评分的线性效应具有统计学意义，因素2与因素1、3、4之间均有显著的交互作用。结果见表7。

2.7.6 最佳工艺条件的预测 采用Design-Expert 11软件，根据拟合方程预测酒黄精炮制工艺的最佳条件，同时绘制1、2、3、4对综合评分的响应面图，具体见图3。以综合评分最大值为优化目标，预测的最优炮制工艺为润制时间4.68 h、蒸制时间1 h、蒸制压力0.06 MPa、焖制时间7.18 h，根据试验结果结合生产实际，确定酒黄精最佳炮制工艺为润制时间5 h、蒸制时间1 h、蒸制压力0.06 MPa、焖制时间7 h。

表7 二次多项式方程模型方差分析

Table 7 Variance analysis of quadratic polynomial equation model

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性方差来源平方和自由度均方F值P值显著性 回归模型1 378.781498.495.760.00极显著X3X47.1717.170.420.53 X137.60137.602.200.16 X12339.281339.2819.850.00 X25.7715.770.340.57 X22112.091112.096.560.02 X30.2210.220.010.91 X32120.581120.587.050.02 X448.07148.072.810.12 X42373.321373.3221.840.00 X1X2224.981224.9813.160.00 剩余239.291417.09 X1X315.21115.210.890.36 失拟项116.571011.660.380.90不显著 X1X426.77126.771.570.23 误差122.72430.68 X2X3152.161152.168.900.01 总和1 618.1028 X2X4218.631218.6312.790.00

图3 各因素交互作用的三维响应面图

2.7.7 验证试验 根据优选出的酒黄精最佳炮制工艺，每100克黄精原药材，加20 g黄酒拌匀，润制5 h，置于高压灭菌器中在0.06 MPa蒸制压力下蒸制1 h后，常压焖制7 h，稍晾，切厚片（2～4 mm），60 ℃鼓风干燥，炮制3批酒黄精饮片，测定醇浸出物、水浸出物、黄精多糖、薯蓣皂苷元和5-HMF的含量，实验结果见表8，可知，3批酒黄精饮片的综合评分分别为82.00、82.91、83.76，平均综合评分为82.89，RSD＝1.06%，预测值为82.73，即综合评分实际值与预测值的偏差控制在±3%以内，说明酒黄精炮制工艺进行响应面优化具有一定的稳定性和可靠性，能制备出品质优良、质量稳定可控的酒黄精饮片。

2.8 黄精酒制前后刺激性比较

2.8.1 供试药物制备方法 取生黄精饮片适量，加10倍体积的蒸馏水回流提取3次，每次1 h，趁热滤过，将滤液合并浓缩至1.0 g/mL，给药前用蒸馏水稀释到所需质量浓度，即得生黄精提取液，于4 ℃保存备用。取最佳炮制工艺制备的酒黄精饮片适量，按上述方法制备即得酒黄精提取液。

表8 验证试验结果

Table 8 Validation of experimental results

序号醇浸出物/%水浸出物/%黄精多糖/(mg∙g−1)薯蓣皂苷元/(μg∙g−1)5-HMF/(mg∙g−1)综合评分预测值偏差/%RSD/% 162.6061.6080.5623.670.3182.0082.73−0.891.06 263.5063.7580.7722.930.3882.91 0.21 364.0261.3280.2122.750.6583.76 1.24

2.8.2 分组与给药 取雄性新西兰兔6只，适应性饲养3 d后，给药前检查家兔双眼角膜、虹膜及结膜的情况，如有病变者剔除不用。分别取“2.8.1”项下生黄精和酒黄精提取液的稀释液（0.5 g/mL）0.1 mL，采用自身对照法，将提取液滴入一侧兔眼结膜囊内，作用时间10 s，2 min后立即取生理盐水冲洗，另一侧兔眼滴加等量生理盐水作为对照，观察记录兔眼角膜、虹膜、结膜等局部反应及恢复情况，按照Draize评分标准判断生黄精和酒黄精提取液对兔眼的刺激[32-33]。

2.8.3 结果 生黄精提取液和酒黄精提取液对兔眼的刺激强度评分结果见图4，结果表明，与空白对照组相比，生黄精组对兔眼的刺激性作用较明显，主要表现为血管充血，虹膜和角膜部位均出现炎症、水肿现象。酒黄精组均未见明显结膜充血、结膜水肿、虹膜损害和角膜损害等现象，各组均未见其他毒性反应。

图4 家兔眼刺激性实验结果

2.9 黄精酒制前后对免疫调节作用影响研究

2.9.1 供试药物制备方法 提取液的制备同“2.8.1”项下方法。

2.9.2 动物分组及给药处理方法 取BALB/c系小鼠，适应性喂养1周后，随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组和生黄精低、中、高剂量组及酒黄精低、中、高剂量组，每组6只。按照小鼠与成人体表面积换算方法进行剂量换算[34-35]，设置生黄精和酒黄精低、中、高3个剂量组，剂量分别为2.5、5.0、10.0 g/kg。除空白组注射生理盐水外，其余组均ip 80 mg/kg环磷酰胺3 d，建立小鼠免疫抑制模型。造模完成后，空白组和模型组ig生理盐水，阳性药组ig剂量40 mg/kg的盐酸左旋咪唑，给药组按照不同的剂量ig，每日1次，连续20 d。

2.9.3 脏器指数测定[36-37]将各组小鼠处死并解剖，取出脾脏和胸腺，用生理盐水清洗并用滤纸将表面血迹吸干，准确称定质量，分别计算脾脏指数和胸腺指数。

脾脏指数＝脾脏质量/体质量

胸腺指数＝胸腺质量/体质量

黄精酒制前后对免疫抑制小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响见表9。与空白对照组比较，模型对照组小鼠胸腺指数、脾脏指数均显著降低（＜0.01），结合模型对照组小鼠的行为表现及相关形态，说明实验已成功构建小鼠免疫抑制模型。与模型对照组比较，阳性对照组小鼠的脾脏指数、胸腺指数明显升高（＜0.01）。不同剂量的生黄精、酒黄精组的胸腺指数呈剂量相关性升高，其中酒黄精中、高剂量组还能显著升高胸腺和脾脏指数（＜0.01）。同时，酒黄精低、中剂量组与生黄精低、中剂量组相比，脾脏指数具有显著性差异（＜0.05）。综上所述，生黄精组和酒黄精组均可提高小鼠的胸腺指数和脾脏指数，且提高效果随着给药浓度的增加而增强，同等给药剂量，酒黄精组小鼠的胸腺指数、脾脏指数均高于生黄精组，提示酒黄精可明显提高动物免疫器官功能水平，且效果优于生黄精。

表9 小鼠免疫脏器指数(, n = 6)

与空白对照组比较：**＜0.01；与模型对照组比较：#＜0.05##＜0.01；与生黄精同等给药剂量组比较：▲＜0.05▲▲＜0.01，下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group;▲< 0.05▲▲< 0.01equal dosage group of, same as below tables

2.9.4 外周血细胞测定[38-39]眼眶取血，精密移取20 μL，用血液分析仪测定全血红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）值。黄精酒制前后对免疫抑制小鼠外周血细胞的影响见表10。与空白对照组比较，模型对照组小鼠WBC、RBC、HGB和PLT均显著降低（＜0.01）。与模型对照组比较，阳性对照组WBC、RBC、HGB和PLT显著升高（＜0.01）；生黄精低剂量组小鼠WBC、RBC显著升高（＜0.01）；生黄精中剂量组WBC、RBC、PLT显著升高（＜0.01）；生黄精高剂量组WBC、RBC、HGB和PLT均显著升高（＜0.01、0.05）；酒黄精低剂量组WBC、RBC和HGB显著升高（＜0.05、0.01）；酒黄精中、高剂量组WBC、RBC、HGB和PLT均显著升高（＜0.01、0.05）。同时，酒黄精低、中、高剂量组与生黄精低、中、高剂量组相比较WBC、HGB有显著性差异（＜0.05）。以上结论提示酒黄精可明显增加免疫抑制模型小鼠的外周血细胞，且效果优于生黄精。

2.9.5 碳廓清试验 于最后一次给药1 h后，将印度墨汁（按1∶3体积比加生理盐水稀释）注入小鼠尾静脉[40]，分别于注射后2 min和10 min，用采血毛细管从眼内眦静脉丛取20 μL血样加入配制好的2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。选择Na2CO3溶液作为空白对照，用酶标仪在600 nm处检测值[41]。不同时间点取样测定值记作1、2，处死小鼠，解剖取出肝脏和脾脏并称定质量，按公式计算碳廓清指数（）和吞噬指数（）[42]。

表10 小鼠外周血白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板计数(, n = 6)

＝(lg1－lg2)/(2－1)

＝体质量/(肝质量＋脾质量)×1/3

黄精酒制前后对免疫抑制小鼠碳粒廓清功能的影响见表11。与空白对照组比较，模型对照组小鼠和均显著降低（＜0.01）。与模型对照组比较，阳性对照组小鼠和均显著升高（＜0.05、0.01）。生黄精低、中剂量组均显著升高（＜0.05、0.01），高剂量组和均显著升高（＜0.01）；酒黄精不同剂量组均能使和显著升高（＜0.01）。同时，酒黄精低、中、高剂量组与生黄精低、中、高剂量组相比较，、有显著性差异（＜0.01）。综上所述，与模型对照组比较，不同剂量的生黄精组和酒黄精组小鼠的、均有升高，其中酒黄精可明显提高免疫抑制小鼠的碳粒廓清功能，且效果优于生黄精。

表11 小鼠碳K和α(, n = 6)

2.10 黄精酒制前后对降血糖作用影响研究

2.10.1 供试药物制备方法 提取液的制备同“2.8.1”项下方法。

2.10.2 动物分组及给药处理方法 C57BL/6系小鼠适应性喂养7 d后，将小鼠分为空白对照组和造模组，空白对照组饮食正常，造模组饲喂高脂高糖饲料，连续给药30 d，禁食12 h后，造模组ip 70 mg/kg剂量1%链脲佐菌素（溶于pH 4.4，0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，现配现用），72 h后，断尾取血测定空腹血糖≥11.1 mmol/L视为造模成功小鼠，将造模成功的小鼠随机分为模型对照组、阳性对照组和生黄精低、中、高剂量组及酒黄精低、中、高剂量组。空白对照组和模型对照组均ig生理盐水，阳性药组按200 mg/kg剂量ig二甲双胍，生黄精和酒黄精低、中、高剂量组按照不同的剂量ig，每日1次，连续30 d。

2.10.3 小鼠血糖测定 给药结束后，小鼠采用剪尾的方式取血，利用血糖测定仪进行测定，将测定试纸插入仪器中，试纸自然吸入血样，稳定后读取数值。黄精酒制前后对糖尿病小鼠血糖的影响见表12。与空白对照组比较，经过高脂饲料联合STZ诱导后，模型对照组小鼠的血糖水平显著上升（＜0.01）；与模型对照组比较，阳性对照组、生黄精和酒黄精不同剂量组的血糖水平表现出降低趋势（＜0.01、0.05）。

2.10.4 血脂水平测定[43]眼眶取血，静置待分层后，离心取血清，采用自动生化分析仪测定总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low- density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。

表12 糖尿病小鼠空腹血糖(, n = 6)

黄精酒制前后对糖尿病小鼠血脂的影响见表13。与空白对照组比较，模型对照组小鼠TC、LDL-C和TG含量均显著升高（＜0.01），HDL-C含量显著降低（＜0.01），说明已成功构建小鼠糖尿病模型。与模型对照组比较，阳性对照组小鼠TC、LDL-C、TG含量显著降低，具有统计学意义（＜0.01），HDL-C显著升高（＜0.01）；同等5 g/(kg∙d)给药剂量，ig生黄精和酒黄精提取液的小鼠TC含量显著降低（＜0.05、0.01）；同等10 g/(kg∙d)给药剂量，生黄精组小鼠TC、TG含量显著降低（＜0.05、0.01），酒黄精组小鼠TC、LDL-C和TG含量显著降低（＜0.01、0.05），HDL-C含量显著升高（＜0.05）。同时，与生黄精高剂量组相比，酒黄精高剂量组小鼠TC、LDL-C和TG含量均有统计学意义（＜0.05）。综上所述，不同给药剂量的生黄精、酒黄精提取液均可降低小鼠TC、LDL-C和TG含量，增加HDL-C含量，生黄精和酒黄精提取液对2型糖尿病小鼠血脂均有一定的改善作用，酒黄精对血脂改善作用优于生黄精。

表13 糖尿病小鼠血脂(, n = 6)

2.10.5 小鼠脏器指数的测定[44-45]将各组小鼠处死并解剖，取出脾脏、肝脏和肾脏，用生理盐水清洗并用滤纸将表面血迹吸干，准确称定质量，按照公式计算脏器指数。

肝脏指数＝肝脏质量/体质量

肾脏指数＝肾脏质量/体质量

黄精酒制前后对糖尿病小鼠脏器指数的影响见表14。与空白对照组比较，模型对照组小鼠肝脏指数、肾脏指数和脾脏指数均显著升高（＜0.01），说明糖尿病小鼠出现肝脏肿大，肾脏损伤、水肿，脾脏体积增大等现象。与模型对照组比较，阳性对照组的脏器指数均显著降低（＜0.01）；生黄精高剂量组肝脏指数、脾脏指数显著降低（＜0.05）；酒黄精中剂量组能显著降低肝脏指数、肾脏指数和脾脏指数（＜0.05、0.01），高剂量组肾脏指数、脾脏指数显著降低（＜0.01）。

给药剂量为5 g/(kg∙d)，酒黄精与生黄精肝脏指数、脾脏指数、肾脏指数有显著性差异（＜0.05）；给药剂量为10 g/(kg∙d)，黄精酒制前后脾脏指数和肾脏指数有显著性差异（＜0.05），肝脏指数无显著性差异。综上所述，生黄精和酒黄精对脏器指数均有一定的调节作用，酒黄精对胸腺、肾脏和脾脏损伤的抑制作用优于生黄精组。

表14 糖尿病小鼠脏器指数(, n = 6)

3 讨论

本实验采用AHP-熵权法结合BBD-RSM优化酒黄精炮制工艺参数，可同时兼具决策人的主观判断和待评价各项指标的客观信息[46]，提高了数据的合理性和工艺参数的科学性，可以比较准确地从药效物质的角度更加公正地评价酒黄精工艺的相关参数。验证实验结果表明，在润制时间5 h、蒸制时间1 h、蒸制压力0.06 MPa、闷润时间7 h的工艺条件下，酒黄精的指标成分黄精多糖、薯蓣皂苷元、醇浸出物、水浸出物、5-HMF的平均综合评分为82.89，与模型理论预测值基本一致，表明该模型准确性高，制备的酒黄精饮片质量稳定，能够较合理地应用于酒黄精炮制工艺的优化，本研究优化的酒黄精炮制工艺只是小试结果，最终的生产工艺仍需要进行中试放大试验进行验证。

黄精生品刺人咽喉，炮制后刺激性减弱，同时能够增强补脾润肺、益肾的作用。在炮制减毒方面，本研究利用兔眼刺激性试验比较了黄精酒制前后刺激性作用，结果表明，生黄精具有刺激性，酒制后刺激性减弱。有文献认为黏液质是黄精刺激性成分，炮制后黏液质被大量破坏，从而减轻对咽喉的刺激性[47-48]；也有报道炮制后正己醛、莰烯等挥发性成分含量减少，可能是黄精的刺激性成分[49]，但以上均是推测，缺少实验数据证实。胡菊[14]利用家兔眼刺激性和皮肤刺激性实验筛选出黄精刺激性成分认为可能为黄精针晶，其实验所用的黄精生品由滇黄精鲜品60 ℃干燥制得，但由于黄精传统加工方法为“黄精鲜品-去杂-洗净-蒸煮-干燥-黄精生品”[50-52]，蒸煮后再干燥的黄精生品是否具有刺激性有待深入研究。

在炮制增效方面，本研究采用ip环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，运用高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素构建2型糖尿病小鼠模型，比较黄精酒制前后免疫调节和降血糖作用，实验结果表明，黄精酒制后可以增强免疫调节和降血糖作用。目前，黄精的药效物质基础研究多集中于黄精多糖，《中国药典》2020年版[1]也以多糖作为黄精的质量评价指标。由于黄精在炮制过程中发生了美拉德反应，以及多糖发生了水解反应，炮制后多糖含量降低，寡糖和单糖含量升高[53]，并产生了5-HMF，因此仅以多糖作为质量控制指标并不能完全反映黄精炮制前后的药效差异。寡糖作为糖类研究的重要组成部分，本课题组前期研究发现黄精酒制后多糖含量降低，寡糖含量升高，杨云等[54]研究发现黄精寡糖具有促进小鼠非特异性免疫的作用，可增强小鼠体液免疫功能，因此有必要对黄精炮制前后寡糖的成分变化和药效进行深入研究，为进一步阐明黄精炮制增效的科学内涵提供研究基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Optimization of processing technology of wine-processedby combination of Box-Behnken design-response surface method and AHP-entropy weight method and comparison of efficacy before and after processing

SHI Shuang-hui, WANG Meng-lin, WEI Xiao-tong, MA Si-yuan, HU Yu-feng, ZHANG Jing-qiu, WANG Hui- nan, CHEN Meng-yu, LIU Qian-qian, WANG Ying-zi

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To optimize the high-pressure steaming process of wine-processed Huangjing (, PR) (wpPR) and determine the best process parameters, and to study the irritation, immune regulation and hypoglycemic effect before and after wine processing.Taking the moistening time, steaming pressure, steaming time and stewing time as investigation factors and characteristics, polysaccharide, diosgenin, water extract, alcohol extract and 5-hydroxymethylfurfural (5-HMF) as investigation indexes, the AHP-entropy weight method combined with the Box-Behnken design-response surface method (BBD-RSM) were used to determine the processing parameters of wpPR. The irritating effect of PR before and after processing was evaluated by rabbit eye irritation test. The immunosuppressive model of mice was established by intraperitoneal injection of cyclophosphamide, and compared the effects of PR before and after processing on immune regulation. The model of diabetes mice was established by feeding high fat and high sugar diet and intraperitoneal injection of streptozotocin, and the effect of PR before and after processing on hypoglycemic effect was compared.The best processing parameters of wpPR was moistening time of 5 h, steaming time of 1 h, steaming pressure of 0.06 MPa and stewing time of 7 h. The results of the pharmacodynamic experiment showed that raw PR was irritant, the irritation of wpPR on mucous membrane is weakened. The effects of wpPR on improving immunity and lowering blood sugar in mice were stronger than raw PR.The comprehensive score of wpPR pieces was higher, the process of wpPR was stable, reasonable and feasible. wpPR prepared by this process can reduce irritation, enhance immune function and hypoglycemic effect, which provided a reference for the processing technology research and clinical medication of PR.

AHP-entropy weight method; Box-Behnken design-response surface methodology; wine-processed; processing technology; irritation; immunomodulatory; hypoglycemic effect; diosgenin; 5-hydroxymethylfurfural

R283.6

A

0253 - 2670(2023)14 - 4467 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.007

2023-01-03

国家重点研发计划（2018YFC1707000）

石双慧（1999—），女，硕士研究生，研究方向为中药制剂新技术与中药炮制原理研究。E-mail: a18801377903@163.com

王英姿（1975—），女，教授，博士生导师，博士，研究方向为中药制剂新技术与中药炮制原理研究。E-mail: wangyzi@sina.com

[责任编辑 郑礼胜]