液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中雷公藤甲素的不确定度评定

曾 辉，邓 楠，刘 川，王朝霞，尹芳平，袁 圆

（长沙市食品药品检验所，国家酒类产品质量检验检测中心，湖南长沙 410000）

在我国云南、广西等南方省份，多次发生食用蜂蜜中毒事件[1]。据文献报道，在1972—2016 年，中毒374 人以上，死亡58 人。有毒的蜜粉源主要有雷公藤、博落回、钩吻等，而能确定有毒蜜粉源植物名称或清楚中毒化学成分的事件未达到1/3，对中毒来源难以追溯[2]。根据2016 年湖北和福建蜂蜜中毒死亡事件的调查，造成致死的有毒蜜源主要是雷公藤和昆明山海棠中的雷公藤甲素[3-4]。人类食用毒蜜后对肝、肾、生殖器官及免疫系统有一定损伤[5-6]。

雷公藤甲素是从雷公藤和昆明山海棠中分离得到的主要活性成分，为二萜类化合物，分子式为C20H24O6，呈白色针状晶体，在水中难以溶解，而在甲醇、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂中容易溶解。根据《蜂蜜中雷公藤甲素的测定》（BJS 202108）用液相色谱-串联三重四极杆质谱测得其含量只是被测量的估计值，测量过程中的随机效应及系统效应均会导致测量不确定度[7]。目前，关于测定蜂蜜中雷公藤甲素的含量还没有不确定度评定的报道，为得到可靠的实验数据，本文对实验过程中的不确定度来源进行分析和评定，从而提高检测检验质量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自制阳性蜂蜜（市售蜂蜜加入雷公藤甲素）；雷公藤甲素标准品（纯度99.6%），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯），默克化工技术有限公司；甲酸（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ME204E 万分之一分析天平（感量0.000 1 g）、XS205DU 十万分之一分析天平（感量0.000 01 g），梅特勒-托利多仪器有限公司；1290-6470 液相色谱-串联质谱仪、SB-C18柱，安捷伦科技有限公司；TurboVap LV 氮吹仪，Biotage；X1R 离心机，赛默飞世尔科技有限公司；Fotector-06 全自动固相萃取仪，睿科集团（厦门）股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

（1）雷公藤甲素标准储备液（1.00 g·L-1）的配制。准确称取10.00 mg 雷公藤甲素标准品于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL。

（2）雷公藤甲素标准中间液（1.00 mg·L-1）的配制。准确量取100 μL雷公藤甲素标准储备液于容量瓶中，用甲醇稀释定容至100 mL。

（3）雷公藤甲素标准工作溶液的配制。准确量取雷公藤甲素标准中间液用空白样品基质稀释，分别配制成2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、25 μg·L-1、50 μg·L-1和80 μg·L-1的基质标准工作溶液。基质标准工作曲线以基质标准工作溶液浓度为横坐标，纵坐标为峰面积绘制。

1.3.2 样品处理

称取2 g蜂蜜（精确至0.1 mg）于50 mL离心管中，加入4 mL 水与蜂蜜混匀，加入15 mL 乙酸乙酯涡旋振荡5 min 再超声10 min 提取，高速离心5 min，取上清液。再加入15 mL 乙酸乙酯提取1 次，合并两次提取的上层有机溶剂，旋转蒸干后用2 mL 乙酸乙酯溶解，过PSA 固相萃取柱，用5 mL 乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液氮气吹干。准确量取1 mL 甲醇溶液复溶，过滤后供液相色谱-串联质谱测定[8]。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：20 ℃；进样量：5 μL；流动相A 为0.1%甲酸溶液，流动相B 为甲醇；梯度洗脱：0 ～0.50 min，90%A；0.50 ～4.00 min，90%A→5%A；4.00 ～6.00 min，5%A→3%A；6.00 ～6.50 min，3%A；6.50 ～7.00 min，3%A→90%A；7.00 ～10.00 min，90%A。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应模式；扫描方式：正离子模式扫描；离子对：361.1/127（定量离子对），361.1/105.2，361.1/141.2；碎裂电压：145 eV；碰撞能量：80 eV。

1.3.4 数学模型

雷公藤甲素含量的计算公式为

式中：X为试样中雷公藤甲素的含量，μg·kg-1；ρ为由标准曲线得出的被测组分溶液质量浓度，μg·L-1；V为定容体积，mL；f为稀释倍数；m为试样质量，g；1 000 为换算系数[9]。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源

测定蜂蜜中雷公藤甲素的不确定度主要来源于标准溶液配制、标准工作曲线制备、样品溶液配制、样品测定重复性和样品加标回收率几个方面。

2.2 不确定度计算

2.2.1 标准溶液配制引入的不确定度urel(r)

（1）标准品纯度引入的不确定度urel(r1)。根据雷公藤甲素标准品的证书，其纯度为99.6%，标准偏差为0.4%，按矩形分布，其标准不确定度为，相对标准不确定度为

（2）标准品称量引入的不确定度urel(r2)。根据天平的检定证书和《电子天平检定规程》（JJG 1036—2008），十万分之一天平称量范围为m＜20 g 时，U=0.000 03 g，k=2，称量过程包含去皮、称重两个步骤，故称取雷公藤甲素标准品0.010 25 g，则

（3）标准品定容引入的不确定度urel(r3)。标准品定容引入的不确定度主要来源于溶剂的膨胀系数、玻璃量器的允许误差[10]。配制标准品的溶液为甲醇，甲醇的膨胀系数为0.001 19 ℃-1，实验室温度为（20±5）℃，故温度偏差产生的溶剂体积增量为10×0.001 19×5=0.059 5 mL，按照均匀分布，包含因子则按照JJG 196—2006 和检定证书，10 mL 容量瓶（A 级）U=0.006 mL，则

则配制雷公藤甲素标准储备液引入的相对不确定度为

（4）标准溶液稀释引入的不确定度urel(r4)。根据检定证书和检定规程，10 ～100 μL 移液器的最大允许误差为±2%，按矩形分布计算，重复度最大允许误差为1%，则。溶剂因温度造成的膨胀系数引入的误差为

故移液器引入的相对标准不确定度为

100 mL 容量瓶用甲醇定容，因温度产生的不确定度为

100 mL 的容量瓶（A 级）U=0.03 mL，则

则容量瓶引入的相对标准不确定度为

标准溶液稀释引入的相对标准不确定度为

因此，由标准品引入的相对标准不确定度为

2.2.2 标准工作曲线制备引入的相对不确定度urel(v)

（1）配制标准工作曲线引入的不确定度urel(v1)。分别用10 ～100 μL 和100 ～1 000 μL 移液器移取标准品中间液20 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL和800 μL 置于10 mL 容量瓶中，用空白样品基质稀释定容至刻度。空白样品基质为甲醇溶液，膨胀系数为0.000 699 ℃-1。配制标准工作曲线过程中玻璃容器和移液器引入的不确定度详见表1。

表1 配制标准工作曲线引入的不确定度

（2）标准工作曲线拟合引入的不确定度urel(v2)。标准工作曲线测3 次，按照外标法拟合，得到线性方程为Y=66.780 168 73X-5.129 430 26，其相关系数R2=0.997 1，标准系列工作溶液峰面积的标准偏差为

标准系列工作溶液的相对标准不确定度为

标准曲线引入的不确定度见表2。

表2 标准工作曲线拟合引入的不确定度

2.2.3 样品溶液配制引入的不确定度urel(m)

（1）试样称量引入的不确定度urel(m1)。根据天平的检定证书和检定规程，万分之一的分析天平U=0.000 3 g，k=2，样品重复称量7 次，平均值为2.072 0 g，故相对标准不确定度为

（2）样品定容体积引入的不确定度urel(m2)。样品用1 mL 甲醇溶液复溶，按照均匀分布，包含因子则按照检定证书和检定规程，100 ～1 000 μL 的移液器最大允许误差为1%，则0.005 77 mL，重复度最大允许误差为0.5%，则样品定容体积引入的相对标准不确定度为

样品溶液配制引入的相对合成不确定度为

2.2.4 样品测量重复性引入的不确定度urel(s)

对同一样品取7 平行，测得样品含量分别为0.998 7 μg·kg-1、0.972 5 μg·kg-1、1.010 1 μg·kg-1、0.987 7 μg·kg-1、1.076 0 μg·kg-1、1.005 3 μg·kg-1和1.010 5 μg·kg-1，平均值为1.008 7 μg·kg-1，标准偏差为S=0.032 7，urel(s)=0.012 2。

2.2.5 样品的加标回收率引入的不确定度urel(f)

称取样品2 g，添加3 μg·kg-1雷公藤甲素标准品，测得回收率分别为95.56%、95.82%、96.03%、97.49%、99.74%、104.23% 和100.22%，平均值为98.44%，回收率的标准偏差为回收率的相对标准不确定度为

2.3 合成相对标准不确定度

合成相对不确定度为

标准溶液配制、标准工作曲线制备、样品溶液配制、样品测定重复性和样品加标回收率的不确定度贡献率分别为16.12%、49.15%、7.49%、13.56%和13.68%。

2.4 扩展不确定度

样品中雷公藤甲素的含量为1.01 μg·kg-1，在95%置信区间，包含因子k=2，则扩展不确定度为2×0.050 3×1.01=0.10 μg·kg-1。

雷公藤甲素含量为X=（1.01±0.10） μg·kg-1，k=2。

3 结论

对自制阳性样蜂蜜中的雷公藤甲素根据《蜂蜜中雷公藤甲素的测定》（BJS 202108）进行检测，其结果平均值为1.01 μg·kg-1，扩展不确定度为0.10 μg·kg-1，结果表示为X=（1.01±0.10） μg·kg-1，k=2。在雷公藤甲素检测过程中，对标准溶液配制、标准工作曲线、样品溶液配制、样品测定重复性、样品加标回收率5 个方面的相对标准不确定度进行分析，标准工作曲线制备的不确定度最大，贡献率达49.15%，其中包括标准曲线的配制及标准工作曲线的拟合，为控制实验结果的准确性，应选取检定合格的玻璃量器及移液器，使用合适的标准曲线浓度点，使阳性样品浓度在合适的范围内进行测定，在适宜的温度环境下，严格按照标准进行规范操作，从而降低标准曲线引入的不确定度。