枸杞叶HPLC特征图谱的研究

郑倩倩 周雪菲 路丽娟 王小芳 赵艳普

【摘 要】   目的： 采用HPLC法研究枸杞叶的特征图谱。 方法： 采用HPLC法，以槲皮素为参照物，色谱柱为Agilent 5TC-C18（2）5 μm，250 mm×4.6 mm，以甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为360 nm，柱温为 35 ℃。流速为1.0 mL/min。利用《中药指纹图谱相似度评价系统（2012年版）》对数据进行整理分析。 结果： 建立了枸杞叶的HPLC特征图谱，共确定7个特征峰，以槲皮素峰为参照（S），10批枸杞叶样品的相似度均＞0.900。 结论： 该方法操作简便，专属性好，可为枸杞叶的质量标准研究和质量评价提供参考依据。

【关键词】  枸杞叶；HPLC；特征图谱；槲皮素

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】A    【文章编号】1007-8517（2023）13-0034-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202313008

Study on HPLC Characteristic Spectra of Lycium Barbarum Leaves

ZHENG Qianqian ZHOU Xuefei LU Lijuan WANG Xiaofang ZHAO Yanpu

Shijiazhuang Food and Drug Inspection Center，Shijiazhuang 050000，China

Abstract：  Objective  To study the characteristic spectra of Lycium barbarum leaves by HPLC.  Methods  the HPLC method was used， with quercetin as the reference substance， and the chromatographic column was Agilent 5TC-C18 （2） 5 μm， 250 mm×4.6 mm， methanol-0.4%phosphoric acid solution as mobile phase， gradient elution， detection wavelength of 360 nm， column temperature of 35 ℃. The flow rate was 1.0 mL/min. The data were collated and analyzed using the similarity evaluation system of traditional Chinese medicine fingerprints （2012 Edition）. Results  The HPLC characteristic chromatogram of Lycium barbarum leaves was established， and seven characteristic peaks were determined. With quercetin peak as reference （S）， the similarity of 10 batches of Lycium barbarum leaves samples was>0.900.  Conclusion  the method is simple and specific， and can provide reference for quality standard research and quality evaluation of Lycium barbarum leaves.

Key words： Lycium Barbarum Leaves； HPLC； Characteristic Map； Quercetin

枸杞叶又名天精草、地仙苗、甜菜等，为茄科植物枸杞（ Lycium chinese  Mill）或宁夏枸杞（ Lycium barbarum  L.）的干燥嫩茎叶，《本草纲目》中谓其味苦甘而气凉，具除烦益志，补五劳七伤，壮心气之功效，亦可“去皮骨节间风，消热毒，散疮肿，除风明目”［1］。常炒食或用作茶叶。

枸杞叶主要含有多酚类、多糖类、黄酮类、维生素、甜菜碱，还含有多种微量元素， 现代研究［2-8］表明，枸杞叶有抗炎抗病毒、降血糖、降血脂、抗氧化，抗疲劳等药理作用，还可以用于降血脂，预防动脉粥样硬化。

中药材化学成分复杂，而中药特征图谱具有整体性和模糊性的特点，作为一种鉴别的手段，可用于鉴别药材真伪、评价药材道地性以及制剂的一致性与稳定性，是一种综合的可量化的鉴别手段 ［9-12］。

枸杞叶作为一种传统的中药材，日渐受到关注，孟协中等［13］进行了枸杞叶的化学成分研究，刘赛等［14］对不同产地枸杞叶片中多糖、总黄酮和总酚含量进行了差异比较分析，有学者［15-16］进行了枸杞叶的药理活性研究，亦有学者［17-19］对枸杞叶中的黄酮提取物进行了纯化、提取工艺优化及组成结构分析。枸杞叶专属性的鉴别项目研究未见报道，枸杞叶 特征图谱的相关质量标准亦未建立，为鉴别市面上的枸杞叶产品真伪，很有必要建立其特征图谱。本研究采用HPLC法，研究并建立枸杞叶的特征图谱，以期更全面控制枸杞叶的质量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）； Satouris电子天平（德国赛多利斯公司）；Milli-Q超纯水机（美国默克公司）；FW100高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；色谱柱Agilent 5TC-C18（2）5 μm，250 mm×4.6 mm。

1.2 试药 对照品：槲皮素（批号100081-201509），购于中国食品药品检定研究院。试剂：甲醇（色谱纯，Merck）；水（去离子水，电阻率≥18.2 MΩ·cm）；乙醇 （分析纯，天津科密欧）；36%盐酸（分析纯，天津科密欧）；磷酸（分析纯，天津科密欧）。药材：共收集到枸杞叶药材10批，分别来自河北（6批）、宁夏（4批）等地，经石家庄市食品药品检验中心业务办公室毕飞霞副主任药师鉴定为茄科植物枸杞（ Lycium chinese  Mill）或宁夏枸杞（ Lycium barbarum  L.）的嫩茎叶。药材信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序为0～10 min，10%A；11～30 min，10%→35%A；31～50 min，35%→80%A；50～55 min，80%A。流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为360 nm；进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 将枸杞叶样品粉碎，过三号筛，取粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，取出，放冷至室温，再用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL至蒸发皿中，水浴蒸干，加入甲醇-25%盐酸（4∶ 1）的混合溶液25 mL，加热回流40 min，取出，放冷至室温，分次转移至50 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制备成50 μg/mL的对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密称取枸杞叶样品粉末（GQY-6）1.0 g共1份，按照“2.2.1”项供试品的制备方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件连续进样6次，各次进样量均为10 μL，记录6次进样的HPLC图，以5号峰（槲皮素 峰）为参照峰，分别计算7个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果为相对保留时间RSD均＜0.4%，相对峰面积的RSD均＜0.5%，表明此方法精密度良好。

2.3.2 重复性试验 精密称取枸杞叶样品粉末（GQY-6）1.0 g共6份，按照“2.2.1”项供试品的制备方法，平行操作，制备6份供试品溶液，按“2.1”色谱条件分别进样，各次进样量均为 10 μL，记录各个HPLC图，以5号峰（槲皮素峰）为参照峰，分别计算7个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果为相对保留时间的RSD均＜0.9%，相对峰面积的RSD均＜0.6%，表明此方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 精密称取枸杞叶样品粉末（GQY-6）1.0 g共1份，按照“2.2.1”项供试品的制备方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，各次进样量均为10 μL，记录各个HPLC图，以5号峰（槲皮素峰）为参照峰，分别计算7个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果为相对保留时间的RSD均＜1.1%，相对峰面积的RSD均＜1.3%，表明此样品的供试品溶液放置 24 h 稳定性良好。

2.4 特征图谱的建立及评价 分别精密称取10批枸杞叶的样品粉末各1.0 g，按照“2.2.1”项供试品的制备方法制备供试品溶液10份，按“2.1”色谱条件依次进样，进样 量均为10 μL，记录色谱图，将10个样品的HPLC图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》，将S1图谱设置为参照图谱，时间窗口选择为0.1 min，用中位数法生成对照图谱（R），通过多点校正，进行色谱峰匹配，共确定了7个特征峰，通过对照品比对，DAD全波长扫描图的对比，指认了其中1个成分，为槲皮素峰（5号峰）。槲皮素作为枸杞叶中黄酮类主要成分，含量较大，出峰时间居中，分离度好，且较稳定，故将槲皮素峰（5号峰）设为设为参照峰（S峰），计算10批枸杞叶样品图谱的相似度，特征图谱叠加图谱及相似度计算结果如图1所示、见表2。

10批枸杞叶样品的相似度均＞0.900，说明各批样品成分相似度高，所建立的特征图谱有较高的代表性，可行性好。10样品的特征图谱均呈现7个特征色谱峰，以槲皮素峰为参照峰（S），7个特征峰的平均相对保留时间分别为：0.143（峰1）、0.220（峰2）、0.443（峰3）、0.765（峰4）、1.000（S峰）、1.652（峰6）、1.886（峰7）。10批枸杞叶样品的相对保留时间＜2.0%，说明所建立的特征图谱重复性好，稳定可行。7个特征峰的平均相对峰面积分别为：0.233（峰1）、0.136（峰2）、0.091（峰3）、0.079（峰4）、1.000（S峰）、0.058（峰6）、0.082（峰7）。10批样品的相对峰面积的RSD值较大，尤其是峰6，RSD值达到77.97%，说明河北产和宁夏产的枸杞叶样品存在一定差异，而同产地的不同批次枸杞叶样品差异不大，可能和地域、气候，栽培方式不同有关。7个特征峰的相对保留时间及相对峰面积见表3、表4。

3 讨论

3.1 提取溶剂、提取方式及色谱条件的优化 提取溶剂分别考察了70%甲醇，70%乙醇，85%乙醇等，结果显示发现70%乙醇为溶剂时，出峰最多，且各峰的峰面積最大，故选择了70%乙醇为提取溶剂。提取方式考察了加热回流和超声两种提取方式，结果显示加热回流方式提取较完全，各峰峰面积较大，提取效果较好，料液比考察了1∶ 50，1∶ 75，1∶ 100，结果显示料液比为1∶ 50时，提取最完全，各峰响应值最高。通过考察不同加热时间，最终确定了2.2.1项下的制备方法。

流动相考察了甲醇-水、甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液等不同溶剂系统，通过DAD检测器在200～400 nm波长范围进行扫描。又考察了不同柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃）和流速，通过对比出峰数量、各峰响应值大小，最终确定了2.1项下的色谱条件。

3.2 结果分析 本研究建立了枸杞叶的HPLC特征图谱，并通过对照品比对确认了其中槲皮素成分。以槲皮素峰为参照峰（S），取特征图谱相对保留时间的±5%的范围，建议7个特征峰的相对保留时间分别规定为：0.14～0.15（峰1）、0.21～0.23（峰2）、0.42～0.47（峰3）、0.73～0.80（峰4）、1.000（S峰）、1.57～1.73（峰5）、1.79～1.98（峰7）。其余峰还需进一步确证。7个特征峰的相对保留时间RSD均≤2.0%，说明所建立的特征图谱具有较好的重复性和稳定性。产地分别为河北、宁夏的10批枸杞叶样品的相似度均＞0.900，说明各产地枸杞叶成分相似度高，本研究所建立的特征图谱有较好的代表性和特征性，可为枸杞叶质量控制提供参考。

参考文献

［1］明·李时珍.本草纲目（校点本下册）［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2013：2113.

［2］陈雅林，谭芳，彭勇，等.  枸杞叶的研究进展［J］.中国药学杂志，2017，52（5）：358-361.

［3］张玉玺，马红军，何薇. 宁夏枸杞菜中总黄酮和芦丁含量的动态变化研究［J］.当代化工，2014，43（12）： 2509-2510.

［4］ 姚遥，水栋，田建英，等. 宁夏枸杞叶中的化学成分［J］.北京中医药大学学报，2016，39（6）：498-501.

［5］李红英，吴东. 宁夏枸杞叶茶中微量元素含量与其他茶叶的比较［J］.微量元素与健康研究，2008，（4）： 34-35，50.

［6］何微，朱捷. 枸杞叶中总黄酮及芦丁提取工艺的研究［J］.当代化工，2015，44（11）：2723-2725.

［7］杨玉新，方珍. 枸杞叶有效成分及其提取方法简析［J］.黑龙江农业科学，2014，（12）：150-152.

［8］文怀秀，蒋福全，赵晓辉，等. 不同采收期宁夏枸杞叶中总黄酮含量的比较［J］.植物资源与环境学报，2006（3）：75-76.

［9］ 段吉平，姚宝林，杨建玲，等. 当药HPLC特征图谱的探索［J］.中国實验方剂学杂志，2017，23（21）：75-78.

［10］ 江俊.中药质量评价新方法—中药指纹图谱［J］. 湖北中医学院学报，2001（4）： 11.

［11］胡汉昆，刘薇芝，刘萍，等. 中药特征图谱技术在中药鉴定中的应用［J］.中国医院药学志，2009，29（11）：936-938.

［12］ 秦红霖，李永申.特征图谱技术在中药质量分析中的应用［J］.中国实用医药，2014， 9（7）：253-255.

［13］孟协中，胡向群，张桂兰，等. 枸杞子和枸杞叶化学成分的研究-第2报枸杞子和枸杞叶中的氨基酸［J］. 中药通报，1987（5）：42-44.

［14］刘赛，杨孟可，李叶林，等. 不同产地枸杞叶片多糖、总黄酮和总酚含量差异比较分析［J］.中国中药杂志，2019，44（9）：1774-1780.

［15］孙伟，苗珍花，王亚玲，等. 宁夏枸杞叶对自然衰老小鼠的抗疲劳作用［J］.宁夏医科大学学报，2011，33（3）：204-205，236.

［16］马琪，张建龙，冉新健，等. 复方枸杞叶茶抗疲劳、耐缺氧、耐低温和对血脂的影响［J］. 新疆医科大学学报，2000（2）：153-154.

［17］陈瑾，陈晶华，刘利平，等. 枸杞叶黄酮提取物的纯化及组成结构分析［J］.食品工业科技， 2019， 40（18）：28-34，40.

［18］邹耀洪. 枸杞叶的黄酮类化学成分［J］.分析测试学报，2002（1）：76-78.

［19］缪文玉，李冠文，殷孝莹，等. 新鲜枸杞叶中黄酮提取工艺的优化及抗氧化性分析［J］.山西农业科学，2022，50（5）：762-770.

（收稿日期：2023-10-20 编辑：陶希睿）