羟氯喹减轻肾缺血/再灌注损伤的机制研究

李文，王光策，王锁刚 （.河南中医药大学第一临床医学院，河南 郑州 450046；.河南中医药大学第一附属医院泌尿外科，河南 郑州 450003）

肾缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是引起急性肾损伤（acute kidneyinjury，AKI）、急性肾小管坏死（acute tubular necrosis，ATN）和急性排斥反应（acute rejection，AR）等严重肾脏疾病的重要原因，已成为影响移植受者/肾长期存活的主要障碍［1］。肾IRI 的防治是肾移植研究的焦点和热点，但是目前治疗方法对肾IRI 的保护并不理想。氯喹（chloroquine，CQ）及其衍生物羟氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）于80 余年前推出，在临床主要用于抗疟疾、治疗慢性炎症反应,后经研究发现其免疫调节的药理作用，经过发展开始用于一些自身免疫性疾病，现临床主要用于系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）等疾病。近年来，越来越多的研究表明HCQ 在肾IRI 中的保护作用，但是其作用机制尚不明确，现对HCQ 的药理作用以及在肾IRI 的发挥保护作用的可能机制进行综述。

1 肾缺血/再灌注病理生理机制

IRI 是组织或器官缺血及重获血流灌注或氧供应后，对组织或器官所产生的损伤作用。事实上，广泛的缺血和再灌注会导致相关的病理组织损伤。而相对与心、脑等重要器官，肾脏血供会被削减以满足心脑等重要器官的血供，也因此更容易发生IRI［2］。目前肾IRI 已经明确的机制包括炎症反应、凋亡、自噬、钙超载等。肾IRI 急性期内主要表现为AKI，常出现尿量减少、代谢物异常蓄积、水电解质紊乱等症状，临床表现有水肿、高血压以及血尿等。远期将会导致慢性炎症反应和缺氧，随后可能出现肾小管萎缩、上皮细胞间充质转化，肾间质细胞出现细胞外基质生成分解不平衡，最终导致以肾纤维化为病理基础的慢性肾脏病［3］。

国内外众多专家在肾 IRI 的发生机制方面做了一些研究并取得了重要进展。已明确IRI 共经历4 个阶段：① 起始阶段的缺血性损伤会导致肾组织级联的坏死和凋亡。② 第二阶段主要经历再灌注所带来的的炎症过程，各种细胞因子的释放并伴随中性粒细胞的到来，刺激活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）的产生，同时产生趋化作用和吞噬作用。③ 第三阶段又称为维持阶段，微环境变化不大，肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）稳定、尿量正常。④ 最后，血肌酐值下降，肾小管功能增加，肾结构改善［4］。

2 羟氯喹药理学

HCQ 是 1946 年合成的 4-氨基喹啉衍生物，是一类抗疟疾药。由 CQ 添加羟基衍生而来。这种变化使 HCQ 比 CQ 更易溶解和更安全，使其在保持CQ 生物效应的同时，大大降低了生物毒性。临床上，多用它治疗风湿性疾病，如幼年特发性关节炎 （juvenile idiopathic arthritis，JIA）、SLE、RA 和干燥综合征等［5］。其在IRI 中的生理作用也逐渐受到重视。

HCQ 具有调节免疫、抗炎、免疫抑制、预防血栓、保护血管内皮、降糖调脂、抗感染等多种药理作用［6］，HCQ 还可以抑制 Toll 样受体信号传导，减轻炎症反应，抑制细胞死亡、自噬等［7］。HCQ 免疫调节的的主要作用机制可能包括：① 干扰溶酶体酸化和抑制蛋白水解、趋化，干扰吞噬作用和抗原呈递。② 减少巨噬细胞介导的细胞因子产生，主要是白细胞介素 （interleukin，IL）-1 和 IL-6。③ 抑制磷脂酶A2，从而拮抗前列腺素的作用。④ 吸收和阻断紫外线皮肤损伤。⑤ 结合并稳定DNA。⑥ 抑制 T 和 B 细胞受体钙信号传导［8］。并且HCQ 部分免疫调节靶点与IRI 有着密切的联系。

3 羟氯喹在肾IRI 中可能作用机制

3.1 NLRP3 炎症小体是含有NACHT、LRR 和PYD结构域的蛋白，是一种细胞质大分子复合物，可以通过诱导半胱天冬酶-1（caspase-1）激活和促使IL-1β 成熟来参与调节固有免疫。NLRP3 炎症小体可以被线粒体ROS、钾外流和溶酶体组织蛋白酶的释放激活［9-10］。目前大量研究证实NLRP3 炎性小体在调节IgA 肾病等原发性肾小球疾病，以及肾IRI所引起的继发性肾小球肾小管疾病方面有重要作用［11-12］。Iyer 等［13］通过动物实验证明坏死小管细胞能够通过释放存活的线粒体激活巨噬细胞中的NLRP3 炎性小体，NLRP3 炎性小体的减少对小鼠肾脏IRI 所致的炎症和组织损伤具有保护作用。Bakker 等［14］报道NLRP3 具有组织特异性的作用，白细胞相关NLRP3 与小管细胞凋亡有密切相关，而肾相关NLRP3 则对创面愈合有拮抗作用。肾小管细胞相关NLRP3 的缺乏对细胞再生具有改善作用。Tang T 等［15］通过鼠和HK-2 细胞实验表明，IRI 可导致NLRP3 炎症小体激活的增加，这种病理现象可被HCQ 所抑制，因此HCQ 对IRI 中炎症的改善可能是通过抑制NLRP3 炎症小体的激活。这些发现表明NLRP3 炎症小体可能是治疗肾IRI 的潜在靶点。

3.2 羟氯喹通过拮抗Toll样受体9 （toll-like receptor 9，TLR9）抑制中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）形成缓解肾IRI：研究表明NETs 在IRI 中具有重要的病理学作用。NETs 是由中性粒细胞形成的网状结构，主要由DNA 和组蛋白（包括细胞外组蛋白和中性粒细胞颗粒蛋白）组成，中性粒细胞可以通过它捕获和杀死入侵的微生物［16］。在IRI 中组蛋白和中性粒细胞可以直接损伤血管内皮细胞进而影响肾功能，同时组蛋白作为一种损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）可以激活TLR9 促进NETs 形成，NETs 可激活NLRP3 炎症小体使免疫系统增强免疫反应来损伤相关组织细胞［17］。TLR9 是免疫系统和NETs、DAMPs 和IRI 恶性循环中的重要模式识别受体。Zhang 等［18］通过SCID 小鼠和c57BL/6 小鼠模型，表明HCQ 可以通过抑制肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（peptidylarginine deiminase type 4，PAD4）和Rac 家族小GTP 酶2 （rac family small GTPase 3，Rac 2）的表达抑制NETs 的形成减轻肝脏IRI，并且该作用可被TLR9 激动剂所逆转。除此之外，HCQ 还可以通过抑制TLR9 的信号传导影响树突状细胞（dendritic cells，DCs）的成熟，进而影响机体免疫功能［19］。这可能表明HCQ 和其他TLR9 拮抗剂在临床中可以用于预防肝脏IRI。

3.3 羟氯喹预处理通过增强ERK1/2 磷酸化减轻心肌缺血/再灌注损伤：细胞外信号调节激酶 1/2 （ERK 1/2）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于促分裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，广泛存在于真核细胞中。ERK 1/2 通常位于细胞质中，细胞内和细胞外刺激（生长因子、神经递质、炎症、缺血、缺氧等）通过经典的 Ras-Raf-MEKERK 1/2 通路诱导 ERK 1/2 Ⅷ 区域的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而导致 ERK 1/2 的激活。活化的ERK 1/2 可以使细胞质或细胞核中的底物磷酸化，从而在表面受体到细胞核的信号转导中发挥关键关键作用，诱导特定蛋白质的表达或活化，调节细胞增殖、分化、凋亡和其他过程［20］。研究证实，ERK 1/2 在各个器官的IRI 中均有异常表达，并在IRI 发挥重要作用［21］。ERK1/2 和另一种蛋白激酶Akt 可以构成再灌注损伤挽救性激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）通路，RISK 相关通路已经被证实在心肌IRI 中发挥重要作用［22］。Bourke 等通过羟氯喹预处理体内、体外实验证实了HCQ 对大鼠IRI 的心肌细胞的保护作用，并且其保护可以被ERK1/2 抑制剂 U0126 所阻断，并通过剂量依赖实验，发现HCQ 是通过以剂量依赖性方式增强 ERK1/2 磷酸化来发挥保护作用。除此之外，HCQ 和西地那非可以通过模仿 RISK 途径，在心肌梗塞 （myocardial infarction，MI）时启动细胞保护作用［23-24］。

3.4 羟氯喹通过缺血后期抑制自噬减轻肾IRI：自噬（autophagy）在肾IRI 中发挥重要作用，自噬是对组织细胞内代谢产物的处理加工的过程，清除受损或不需要的细胞器或大分子蛋白质，其是一种细胞抵抗外界刺激或损伤的自适应防御的方式，对于维持细胞稳态有着重要作用。在肾IRI 中，缺氧可以诱导线粒体自噬的发生，线粒体自噬（mitophagy）是一种特异性自噬，通过自噬机制特异识别受损或功能异常的线粒体，将其包裹后传输到自噬体中并与溶酶体融合进行线粒体裂解，从而维持细胞内环境稳定的过程［25-26］。线粒体自噬是目前国内外的研究热点，越来越多的证据提示，在肾IRI 中，自噬是把双刃剑，自噬在激活固有免疫和适应性免疫中具有重要作用，不仅能增强先天性和适应性免疫反应，还能与免疫相关的细胞因子、受体和配体同时增强自噬作用［27］。与此同时，自噬蛋白可以触发一些特定的免疫反应，限制一些不受控制的免疫激活和炎症的发生［28］。因此，在正常自噬存在的情况下，免疫和炎症反应是平衡的，但如果自噬异常，自噬的自我吞噬与促生存功能失衡，导致细胞死亡。而自噬可能保护作用和有害作用取决于缺血的严重程度、自噬激活程度、IRI 的阶段和一些其他未知因素。Decuypere 等［29］提出在缺血时间较短 （20 ～40 min）时，自噬具有保护作用；但在较长时间缺血（40 ～60 min）后，自噬水平的提高是有害的。研究证明，HCQ 是溶酶体依赖性自噬的有力抑制剂，可以通过抑制溶酶体与自噬体的结合和碱化溶酶体，影响缺氧诱导的线粒体自噬过程，损害自噬蛋白质降解［30］，HCQ 抑制细胞自噬的发生已经成为治疗肿瘤一个新的热点，同时，它也可能成为治疗肾IRI 的新的切入点。

3.5 羟氯喹通过抗血小板、抗血栓形成减轻肾IRI：肾再灌注可启动对血流、细胞有害的炎症通路。在血管系统中，再灌注可以引起内皮细胞受损，导致细胞粘附受体激活，血小板和循环炎症细胞黏附在血管壁上，进而刺激血栓形成并减少毛细血管血流量。在某些情况下，血流虽然在大血管系统中可以得到恢复，但在微血管系统却难以重新建立，继而发生一系列的血栓形成伴炎症。因此，血栓形成在肾IRI 中发挥着关键作用。目前有研究发现，HCQ可能是通过花生四烯酸途径抑制血小板聚集来发挥抗血小板功能，HCQ 还能有效改善动脉壁弹性，减少血流阻力。除此之外，HCQ 还可能通过激活细胞外信号调节激酶5，直接保护血管内皮，减少SLE相关血管血栓事件发生。研究证实，HCQ 抗血栓形成作用可能与HCQ 抑制磷脂双分子膜联蛋白A5 影响抗凝血蛋白的活性有关，HCQ 可以降低抗磷脂综合征血栓形成的风险相关［31］。Rand 等［32］通过使用椭圆光度法和原子力显微镜技术，证明 HCQ 可以抑制抗磷脂抗体 - β2-糖蛋白 Ⅰ 复合物与磷脂双分子层的结合，降低抗磷脂抗体的作用。因此目前认为HCQ 是治疗抗磷脂综合征的一种潜在的额外有效疗法。

3.6 羟氯喹的其他生物作用：IRI 是肾移植过程中不可避免的重要挑战，为避免移植肾严重损害，常以减轻肾IRI 为切入点。肾移植维持阶段，为保证移植肾的长期存活，常需终身服用免疫抑制剂，例如钙调磷酸酶抑制剂、雷帕霉素（mTOR 抑制剂）、霉酚酸酯（mycophenolate mofetil，MMF）和激素等，但免疫抑制剂的长期使用，也伴随着一些不良反应的发生，例如一些代谢综合征（高血脂、高血糖）、骨质疏松等。而HCQ 还可通过降低血栓事件的发生率，减少接受类固醇治疗的患者的代谢不良反应，例如，有效降低总胆固醇和降低空腹血糖浓度，降低动脉粥样硬化的危险因素［33］，还可以预防类固醇长期治疗引起的骨质疏松症［34］。除此之外，Virdis等［35］在SLE 小鼠模型中，证实HCQ 可以减轻由ROS 引起的内皮损伤，并且早期施用HCQ 可通过抗氧化作用发挥血管保护作用。Gómez-Guzmán M等［36］在狼疮小鼠中发现，尽管SLE 特异性抗体抗双链DNA 持续升高，但经过长期的HCQ 治疗，可减少内皮功能障碍和器官损伤。

4 总结及展望

肾脏作为人体重要的器官，是 IRI 最易感的器官之一，肾IRI 是急性肾损伤（acute renal injury，AKI）和继发性肾功能丧失的主要原因，并伴随着严重的发病率和病死率［37］。IRI 也是器官移植和心胸、血管和普通外科手术中的主要挑战，特别在器官移植中发生率高达 20%～50% ，并进一步导致移植肾功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）、急性排斥反应（acute rejection，AR）和影响移植肾的长期存活［38-39］。在过去10 年中，对IRI 的机制有了一定的进展，涉及炎症反应和一系列的免疫调节反应，例如自噬、凋亡、纤维化和细胞增殖等。在这一背景下使得在制定相关治疗措施有了更多的新的切入点。HCQ 早期作为抗疟疾药广泛用于临床，后发现还可以用于一些自身免疫疾病，如幼年特发性关节炎 （juvenile idiopathic arthritis，JIA）、SLE、RA 和干燥综合征，应用于生殖免疫领域也有一定的进展［40］，药理作用得到了更深一步的研究，结合HCQ 长期用于临床，HCQ 通常被认为是一种安全的药物。但是其长期使用可能会因为一些严重的不良反应而复杂化，并以视网膜病变为主［41］。近年来发现HCQ 对IRI 有一定的保护作用，其相关机制可能与一些HCQ 诱导的免疫调节作用有关，在一系列复杂的机制中，基于一系列基础研究，HCQ 有几个比较突出的优点。它可以降低器官损伤的风险，还有助于稳定基础代谢（血压、血脂、血糖等），还可以减少类固醇类免疫抑制剂所带来的副作用。不过，尽管HCQ 通过一些基础研究取得了预料中的有利结果，但是需要后期更大规模的后续研究来确认初步的结果。虽然一些小型临床试验效果不佳，但我们知道临床试验总是基于特定的治疗策略（例如给药的剂量和给药时间等），这可能会导致药物无法达到预期的效果。所以我们可以继续对HCQ 保护肾IRI 保持持续的关注。尽管面临挑战，但我们希望肾IRI 的新疗法能很快融入临床实践。