柴胡疏肝散异病同治2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和抑郁症的作用机制

常 硕，刘怀珍，陶庆雪，郭锦晨

1.安徽中医药大学第一临床医学院（合肥230031）；2.安徽中医药大学第一附属医院老年病中心-内分泌科（合肥230031）；3.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室（合肥 230038）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是临床最常见、最重要的代谢性疾病之一，其发病主要与胰岛素缺陷和（或）胰岛素抵抗有关。抑郁症（depressive Disorders，DD）和非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是T2DM 患者常见的并发症。现代研究认为，T2DM、NAFLD 与DD 之间存在某些相互作用，增加了三种疾病发病机制的复杂性，也为临床治疗三种疾病带来了诸多挑战[1]。临床上，T2DM人群患NAFLD 和DD 的概率远大于普通人群[2-3]，这不仅加重了T2DM 患者的致残率、死亡率，更为T2DM 患者的治疗带来了巨大挑战。而传统中医的“异病同治”理念对疾病共病的治疗优势尤为突出，是中医辨证论治的生动体现，它将辨病与辨证有效地连接在一起，促进了中西医结合的发展[4]。

柴胡疏肝散一方出自《医学统旨》，由芍药、川芎、香附、柴胡、甘草、陈皮、枳壳7 味中药组成，全方谨遵《内经》“木郁达之”之旨，具有疏肝解郁，行气止痛之效。秦伯末《谦斋医学讲稿》中指出：“本方即四逆散加川芎、香附和血理气……专以疏肝为目的。”现代药理学研究显示柴胡疏肝散具有抗炎、调节脂质代谢、保肝、抗纤维化、干预神经传递等作用[5]。并且已有临床研究证实此方治疗T2DM[6]、NAFLD[7]、DD[8]疗效确切。本文采用网络药理和分子对接技术探讨柴胡疏肝散异病同治T2DM、NAFLD 及DD 的作用机制，为柴胡疏肝散治疗三病共病提供科学依据，以供临床参考。

1 方法

1.1 柴胡疏肝散药物活性成分的筛选

将柴胡疏肝散全方中的芍药、川芎、香附、柴胡、甘草、陈皮、枳壳分别输入中药系统药理学数据库平台（TCMSP）中，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为条件进行筛选，把结果录入EXCEL 表格中。

1.2 柴胡疏肝散潜在作用靶点筛选及基因名标准化

把1.1 中筛选得到的化合物ID（Mol ID）输入TCMSP数据库，收集每个活性成分的潜在靶点信息，并录入EXCEL中保存。进入UniProt（http://www.uniprot.org）数据库，收集所有已经验证过的人类基因，录入EXCEL，以此基因名作为标准将上一步在TCMSP 数据库中收集到的潜在靶点做标准化命名并保存。

1.3 疾病靶点的筛选

为保证数据的准确与统一，疾病的靶点均在Gene Cards（http://www.genecards.org）数据库中筛选，分别以Type 2 diabetes、Nonalcoholic fatty liver disorder、depressive disorder为检索词，获取疾病的相关靶点。将1.2中标准化后的靶点与疾病靶点分别导入Venny2.1在线平台取交集，得到药物-疾病的共同作用靶点。

1.4 药物-成分-靶点-疾病网络图构建

将柴胡疏肝散中单味药及活性成分，药物-疾病共同靶点导入到Cytoscape 3.7.0软件中，构建成分-靶点-基因-疾病网络图。

1.5 蛋白质互作网络的构建

将1.4 中得到的共同靶点输入到STRING 数据库，以“Homo sapiens”为条件，构建蛋白质互作（PPI）网络图。并将此数据库的分析数据以“tsv”格式保存，导入Cytoscape3.7.0 软件中，以度值（Degree）、介数中心性（Betweenness Centrality）为条件筛选出柴胡疏肝散异病同治T2DM、NAFLD 和DD 的核心靶点，并在Cytoscape3.7.0软件中构建核心靶点网络图。

1.6 基因功能和通路富集分析

将1.5 中得到的核心靶点导入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在线数据库平台，以“OFFICE_GENE_SYMBOL”与“Homo sapiens”为条件，对靶点分别进行生物过程（Biological process，BP）、细胞组分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）分析及Kyoto encyclopedia of genes and gnomes（KEGG）富集通路分析。

1.7 分子对接验证

在PubChem 数据库找出活性成分的2D 结构，在RCS PDB 数据库找出靶蛋白的3D 结构，通过Pymol 2.4.0软件及AutodockTools 1.5.7软件对两者预处理后，在Autodockvina 1.1.2软件中进行对接验证。

2 结果

2.1 药物活性成分的筛选

在TCMSP 数据库中筛选出柴胡疏肝散中各药物有效活性成分数目分别为：陈皮5个、柴胡13个、川芎6个、香附16 个、枳壳5 个、芍药8 个、甘草88 个，删除重复值后，共有123个符合条件的化合物，并将不同药物中相同的活性成分进行统计，见表1。

表1 柴胡疏肝散药物中的共有活性成分Table 1 Common active ingredients in Chaihu Shugan Powder

2.2 药物靶点筛选及基因名标准化

在TCMSP 数据库共筛选出柴胡疏肝散2 995 个潜在作用靶点，其中陈皮95 个、柴胡348 个、川芎42 个、香附496个、枳壳123个、芍药123个、甘草1 768个，将得到的潜在靶点进行标准化处理，删除重复后剩余251个有效靶点。

2.3 药物与疾病交集靶点筛选

对1.3 中获得的3 种疾病的基因靶点进行多次“Relevance score”参数截取，筛选出T2DM相关靶点1 622个、NAFLD相关靶点1 513个，DD相关靶点1 600个，将上述靶点与2.2筛选到的药物靶点取交集，得到交集靶点共70个，见图1。

图1 交集靶点VEEN图Figure 1 Venn diagram of intersecting targets

2.4 药物-成分-疾病-靶点网络图构建

利用Cytoscape3.7.0 软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络关系图，见图2。其中粉色菱形代表药物名称（CX为川芎，CP为陈皮，CH为柴胡，BS为白芍，ZK为枳壳，XF为香附，GC为甘草），黄色圆形和紫色圆形代表药物成分（XF1-XF10 分别代表香附的10 种不同活性成分），紫红色六边形代表药物之间的相同成分（各字母含义见表1），橙色正方形代表药物与疾病之间的共同靶点，绿色箭头形状代表3种疾病。

图2 药物-成分-疾病-靶点网络图Figure 2 Network diagram of Drug-Ingredient-Disease-Target

2.5 PPI网络图及核心靶点网络图构建

根据1.5 步骤筛选得到柴胡疏肝散异病同治T2DM、NAFLD和DD的19个核心靶点。为提高所筛选到的核心靶点的准确性，按照1.4 与1.6 步骤找出柴胡疏肝散分别治疗T2DM、NAFLD、DD 的核心靶点各有39 个、31 个、26 个，将此3 组核心靶点取交集后与上述19 个核心靶点再次取交集，最终得到18 个核心靶点。此18 个核心靶点均在上述19 个靶点中，故以70 个靶点筛选出的核心靶点为依据，构建交集核心靶点网络图，及其可视化分析，见表2、表3 与图3。其中IL6、TNF、AKT1、IL1B、VEGFA 的度值较大，且在2.6 KEGG富集通路中出现的频次分别为11、12、19、8、7次，提示此5个靶点可能为柴胡疏肝散异病同治T2DM、NAFLD和DD的关键靶点。

图3 关键靶点的PPI网络图Figure 3 PPI network diagram of key targets

表2 核心靶点的筛选Table 2 Screening of core targets

表3 关键靶点信息Table 3 Information of key targets

2.6 基因功能分析和KEGG分析

将得到的70 个交集靶点导入至DAVID 在线数据库平台，进行基因功能GO 分析和KEGG 分析，分别得到BP、CC、MF 条目597、55、78 个，以及151 条KEGG 信号通路。以P≤0.01为筛选条件,按P值大小分别选取GO 分析中的前10 条绘制成气泡图，见图4。选取KEGG 分析中的前20 条信号通路（删除与本研究无关的信号通路，如Pathways in cancer，Human cytomegalovirus infection，Amoebiasis 等）做KEGG 基因富集分析图，见图5。

图4 GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis

图5 交集靶点KEGG富集分析Figure 5 KEGG enrichment analysis of intersecting targets

2.7 分子对接验证

现代药理学研究表明[9-10]，柴胡中的主要成分柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 在抗炎、抗抑郁、免疫调节具有显著作用。柴胡是柴胡疏肝散中的君药，故将上述两个主要成分以及表2 中Degree 值靠前的6 个药物成分与核心靶点（TNF、IL6、VEGFA、PPARG、IL1B、AKTI）进行虚拟分子对接，结果显示结合能均≤-6.0 kcal/mol，表明以上活性成分与预期筛选的靶点能够稳定结合，现将所有对接结合能结果制作成热图展示并选取其中结合能较好的对接体进行可视化展示，见图6、图7。

图6 分子对接热图Figure 6 Heat map of molecular docking

图7 分子对接结果Figure 7 Results of molecular docking

3 讨论

胰岛素抵抗与慢性炎症反应贯穿着T2DM 与NAFLD 的发生发展过程，其中胰岛素抵抗的发生可进一步加重炎症反应与脂代谢紊乱，这两种病理过程又分别是DD 和NAFLD 发病的关键机制，由此可见，T2DM、NAFLD 与DD 之间存在复杂的病理反应，使三病互为因果。传统中医认为T2DM 属于“消渴”范畴；NAFLD归属于“肝癖”病[11]；抑郁症则属于“郁证”范畴。此三病虽归属于不同系统疾病，但综合分析三病核心病机总不离“肝郁气滞”[12-14]。《丹溪心法》指出：“气血冲和，万病不生。一有怫郁，诸病生焉”，故临床常以柴胡疏肝散异病同治。全方融疏肝、养肝、健脾于一体，“辛疏酸敛合法，肝脾气血兼顾”，切合消渴、肝癖与郁证的核心病机。

经筛选，发现柴胡疏肝散异病同治T2DM、NAFLD和DD 的主要有效化学成分为槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素等。槲皮素和山奈酚都属于黄酮类化合物，两者均可改善胰岛素抵抗和减轻炎症反应。现代药理学研究认为黄酮类化合物具有抗炎、保护神经、维持血糖平衡等药理作用[15]。有实验验证[16]，槲皮素可以通过改善胰岛素抵抗而对NAFLD有显著疗效，既证明了槲皮素对2 型糖尿病的作用，又阐释了槲皮素治疗NAFLD 的机制。β-谷甾醇对脂代谢有积极作用[17]，目前常应用于非酒精性脂肪肝的治疗和预防。柚皮素属于二氢黄酮类化合物，具有抗炎、降血脂、抗菌、抗氧化、抗癌抗肿瘤等广泛药理作用，在治疗炎症和胰岛素抵抗引发的各种疾病中具有积极意义，如T2DM、NAFLD等[18-19]。

由表3 可知IL6、TNF、IL1B、VEFGA、PPARG 等靶点在药物治疗疾病中可能起着关键作用。TNF-α 与IL6 已被证实为炎症反应的标志物[20]，其中IL6 是一种促炎症细胞因子，其浓度常在炎症反应过程中增加，TNF-α则可以刺激免疫细胞合成IL6、IL1B等炎性细胞因子。IL1β是趋化因子家族中IL1存在的分子形式之一，其过度表达可诱导下游细胞因子的表达，如IL4、IL6、VEGF 等[21]，他们可直接加重炎症反应，影响神经发生和干扰神经可塑性的调节，而抑郁症的发生则与此有关[22]。另外有实验数据表明[23]，IL1β 亦是治疗T2DM的关键靶点，在T2DM患者中使用IL1β受体拮抗剂可显著降低血糖浓度，改善胰岛B 细胞功能。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARG）是一种转录因子[24]，可参与脂肪代谢、炎症反应、胰岛素抵抗等过程。VEGFA 可正向调节海马神经的发生与增殖，提高抑郁患者的认知功能，减少抑郁患者的不良情绪[25]。

GO、KEGG分析结果发现，柴胡疏肝散异病同治过程主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路、Toll 样受体信号通路等。糖基化终末产物（AGEs）是在高血糖状态在经过非酶糖基化反应产生的一种病理产物，是加重糖尿病及其并发症的关键因素，并且其形成过程是不可逆的。AGEs与相应受体（RAGE）相互结合所形成的通路介导了炎症反应、氧化应激反应等过程，加重了胰岛素抵抗和脂代谢紊乱[26-27]。有实验证实[28]，葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）的信号表达可能与缺氧诱导因子-1α（HIF-α）基因表达及其依赖的信号通路有关，其最终结果加重了脂肪组织中的炎症与胰岛素抵抗，当HIF-α基因沉默时，GIP及其诱导的炎症因子表达随之减少。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是介导细胞内外信号传导的重要通路之一，众所周知，MAPK信号通路参与了抑郁症的发病机制[29]。在慢性不可预知轻度应激（CUMS）诱导的抑郁小鼠模型中，MAPK信号通路的活化与小鼠抑郁症状及小鼠体内炎症因子的过度表达相关[30]，且有报告指出，对p38MAPK 信号通路的阻断不仅可以降低IL6、TNF-α等炎症因子的表达，亦可有效发挥抗非酒精性脂肪性肝炎（NASH）作用[31]。Toll 样受体（TLRs）信号通路已经被证实与胰岛素抵抗及神经炎症有密切联系，Luteolin干预慢性炎症及改善胰岛素功能即是主要通过参与此信号通路完成的[32-33]。

分子对接结果表明，通过网络药理学筛选出的柴胡疏肝散的有效活性成分以及柴胡的主要成分与有效靶点之间具有良好的结合能，证明了柴胡疏肝散所含的活性成分与靶点可以有效作用于T2DM、NAFLD 和DD。

4 结论

本文通过网络药理学数据和分子对接技术阐释了柴胡疏肝散通过多靶点、多通路异病同治T2DM、NAFLD 和DD 的作用机制，为中医异病同治理念提供了科学支撑，为T2DM 及其并发症的治疗提供了治疗方案。