豨莶草总黄酮对癫痫大鼠海马神经元损伤及CREB/BDNF信号通路的影响

李祥欣 陈笛 孙军 汪宁 温昌明 张保朝

(南阳市中心医院,河南 南阳 473000)

癫痫以反复自发性发作为特征,影响着全世界超过6 500万人〔1,2〕。虽然抗癫痫药物被认为是最基本的治疗方法,但经过最佳药物治疗后,仍有部分患者癫痫发作〔3〕。此外,目前使用的抗癫痫药物只控制癫痫发作,对导致癫痫的病理变化没有影响,也不能阻断癫痫的过程。因此,寻找有效的措施防治癫痫仍然是研究热点。在临床试验和动物实验中,证据表明,神经炎症和氧化应激在癫痫发作机制中起重要作用,豨莶草是一种常用中药,最早记载于《新修本草》,现代药理学研究发现,豨莶草中含有黄酮类成分,具有抗炎、抗氧化、抗菌等生物学活性〔4〕。已有报道称几种黄酮类化合物可通过增加环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)通路的磷酸化水平来改善神经功能〔5〕。但目前为止,尚未见有关于豨莶草对癫痫的治疗作用。因此,本研究拟通过构建癫痫大鼠模型,探究豨莶草总黄酮对癫痫的药效作用及对CREB/BDNF信号通路的作用机制。

1 材料及方法

1.1动物 SPF级SD雄性大鼠,体质量180～220 g,购自郑州大学,许可证号:SCXK(郑)2017-0001。大鼠自由采食饮水,室温维持在22～25 ℃,相对湿度50%～70%。本研究经动物伦理委员会批准,并遵循医院相关协议进行,根据国家科技部批准发布的“实验动物保护和使用指导意见”进行。

1.2主要试剂及仪器 白细胞介素(IL)-6试剂盒(H007)、IL-1β试剂盒(H002)、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(H052)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(A003)、总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(A001)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(A005)均购自南京建成生物工程研究所。苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(C0105S)、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(C1091)均购自上海碧云天生物科技有限公司。重组Anti-CREB抗体(ab32515)、重组Anti-CREB(phospho S133)抗体(ab32096)、重组Anti-BDNF抗体(ab108319)均购自美国Abcam公司。酶标仪购自瑞士TECAN公司,光学显微镜购自日本Nikon公司,蛋白电泳仪购自北京六一仪器厂,凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3动物模型制备 按照文献〔6〕的方法,在大鼠体内建立了锂-毛果芸香碱诱发的癫痫模型。首先,大鼠腹腔注射127 mg/kg氯化锂。24 h后,腹腔注射阿托品1 mg/kg以抑制胆碱能效应。腹腔注射35 mg/kg毛果芸香碱诱导癫痫持续状态(SE)。监测大鼠的SE发作情况,排除SE持续不明显的动物,因为持续至少1 h的SE是自发性癫痫反复发作的先决条件。注射后15～60 min内出现SE,典型症状包括持续的运动性肢体癫痫发作,并伴有间歇性站立和摔倒,偶尔还会出现狂野奔跑。SE持续1 h后,肌肉注射地西泮4 mg/kg即可停止癫痫发作。如果地西泮不起作用,则再注射腹腔注射3 ml/kg水合氯醛。若根据Racine评分〔7〕评估大鼠癫痫发作的严重程度达到了Ⅳ或Ⅴ级,表明SE模型构建成功。对照组大鼠以生理盐水代替氯化锂及匹罗卡品进行腹腔注射。

1.4动物分组及样本采集 将造模成功的SE大鼠分成模型组、豨莶草总黄酮低剂量组、豨莶草总黄酮中剂量组和豨莶草总黄酮高剂量组,每组12只。再另取12只大鼠作对照组处理。分别给予豨莶草总黄酮低、中、高剂量组5、10、20 mg/kg的剂量灌胃治疗,1次/d,连续4 w。对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.5行为学观察 末次给药结束后24 h,根据Racine分级标准对各组大鼠行为学进行评估。Ⅰ级为面肌痉挛和独立肌阵挛,Ⅱ级为全身性肌阵挛,Ⅲ级为全身性强直性肌阵挛,Ⅳ级为反复全身性强直性肌阵挛或惊厥至死亡,Ⅴ级是指相关的肌阵挛或与死亡有关。

1.6样本采集 行为学观察结束后,用3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。然后将大鼠仰卧位固定,打开胸腔暴露心脏。注射器通过左心室插入升主动脉。切开右心耳,在2 min内灌注150 ml磷酸盐缓冲液(PBS)后,即刻开颅取脑,分离海马组织,左侧海马组织放于4%多聚甲醛中固定,右侧海马组织液氮速冻保存。

1.7炎症因子的检测 取液氮速冻的海马组织,研磨匀浆化,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测海马组织中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.8氧化应激评估 利用ELISA试剂盒对海马组织中MDA、SOD和GSH-Px水平进行检测。

1.9分析海马组织病理变化 将海马组织在4%多聚甲醛固定24 h后,脱水透明,石蜡包埋,切成厚度为4 μm切片。HE染色后光学显微镜下观察海马组织神经元的病理变化。

1.10海马神经元细胞凋亡检测 利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测大鼠海马组织中的细胞凋亡情况。将组织切片常规脱蜡水化,TUNEL反应混合液孵育及染色处理,于显微镜下观察每只大鼠的2张切片。并随机选择每张切片各5个区域,计算每单位面积的TUNEL染色细胞数(核染深褐色阳性细胞),细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.11大鼠海马组织中CREB、BDNF蛋白表达水平测定 用蛋白提取试剂盒提取海马组织匀浆中的总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白含量。使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白,然后将分离蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用5%脱脂奶粉封闭2 h。加CREB、p-CREB、BDNF一抗(稀释倍数为1∶1 000),于4 ℃下过夜孵育,洗膜后加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1∶200)室温孵育1 h,再次洗膜。用化学发光试剂显影,凝胶成像仪观察,ImageJ分析软件对蛋白质条带进行灰度值分析。以β-actin为内参蛋白,分析蛋白质的相对表达量。

1.12统计学分析 采用SPSS22.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1豨莶草总黄酮对SE大鼠行为学的影响 与对照组相比,模型组行为学评分显著升高(P<0.05);与模型组相比,豨莶草总黄酮各剂量组行为学评分显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组行为学评分及海马组织炎症因子水平比较

2.2豨莶草总黄酮对海马组织炎症因子水平的影响 与对照组相比,模型组IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,豨莶草总黄酮各剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α水平显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3豨莶草总黄酮对海马组织氧化应激的影响 与对照组相比,模型组MDA水平显著升高(P<0.05),SOD和GSH-Px水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,豨莶草总黄酮各剂量组MDA水平显著降低(P<0.05),SOD和GSH-Px水平显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组海马组织氧化应激及神经元凋亡、海马组织中p-CREB、BDNF蛋白表达水平比较

2.4豨莶草总黄酮对海马组织病理变化的影响 对照组有大量致密的锥体细胞排列,细胞结构清晰、完整、正常,边缘清晰,染色质分布均匀,胞质内有丰富的尼氏小体。模型组神经元损伤明显,部分神经元丢失,细胞排列紊乱,神经元结构不完整,胞质、胞核缩小,尼氏小体减少。豨莶草各剂量组神经元损伤减轻,高剂量组尤为明显。见图1。

图1 各组海马组织病理(HE染色,×200)

2.5豨莶草总黄酮对海马神经元凋亡的影响 与对照组相比,模型组神经元凋亡率显著升高(P<0.05);与模型组相比,豨莶草总黄酮各剂量组神经元凋亡率显著降低(P<0.05)。见表2、图2。

图2 各组海马神经元(TUNEL染色,×400)

2.6豨莶草总黄酮对海马组织中CREB、BDNF蛋白表达水平的影响 与对照组相比,模型组CREB蛋白的磷酸化水平显著降低(P<0.05);BDNF蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,豨莶草总黄酮各剂量组p-CREB和BDNF蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。见表2、图3。

1～5:对照组、模型组、豨莶草总黄酮低、中、高剂量组图3 Western印迹检测各组CREB、p-CREB、BDNF蛋白表达

3 讨 论

癫痫是一种以反复无故发作为特征的慢性神经系统疾病,由脑神经元过度刺激和超同步性引起〔8〕。SE主要以长时间癫痫活动或频繁发作而不能回到基线状态为特征〔9〕。反复癫痫发作可能导致一系列后遗症,如记忆障碍、生活质量下降和意外死亡〔10〕。尽管在过去几年中癫痫治疗有许多进展,所有癫痫病例中仍有近30%的病例对药物无效,即使在给予最佳药物治疗后癫痫仍持续发作。因此,开发新的癫痫治疗方法非常重要。

豨莶草作为一种传统中药,可以治疗风湿痹痛、四肢麻痹、半身不遂、筋骨无力等症状〔11〕。黄酮类化合物是豨莶草中的一种有效成分,可调节炎症反应,抑制氧化应激。本研究利用锂-毛果芸香碱诱发大鼠SE模型。锂-毛果芸香碱诱发的癫痫大鼠模型的行为和病理特征与人为诱发的损伤相似,例如缺氧、SE、脑外伤、脑卒中、肿瘤或高热性癫痫发作,然后在一段时间的沉默后出现自发性反复癫痫发作〔12〕。癫痫发作会导致海马组织受到严重损害,神经元死亡最终是由一系列细胞死亡级联引起的,这些级联涉及过度的炎症、神经胶质活化、细胞凋亡、氧化应激等〔13〕。本研究表明,豨莶草总黄酮对SE大鼠的神经元损伤具有明显的保护作用。

反复癫痫发作过程中活性氧(ROS)生成增加会引起氧化损伤,甚至导致严重的脑损伤。MDA是氧化应激的关键标志,在多不饱和脂质的氧化降解过程中产生。ROS诱导MDA的产生,进而导致神经毒性和细胞死亡〔14〕。而SOD是一种抗氧化酶,GSH是一种有效的自由基和活性氧清除剂,SOD和GSH水平降低与氧化应激水平增加相关〔15〕。本研究表明,SE的发生发展与氧化应激反应有关,且豨莶草总黄酮可调节SE大鼠的氧化应激反应。毛果芸香碱引起的癫痫发作触发神经胶质活化并促进各种炎症介质的产生,从而引发海马内的一系列炎症过程。促炎分子的释放会破坏神经胶质的正常生理功能,从而影响神经功能。本研究表明,豨莶草总黄酮可抑制SE大鼠的神经炎症。

在中枢神经系统中,CREB可激活长时间活动依赖性突触可塑性所需的信号级联及对ROS介导的细胞毒性的神经保护反应。CREB以磷酸化形式被激活,作用于DNA,促进BDNF蛋白产生〔16〕。BDNF蛋白是一种神经营养因子,可促进神经分化、存活和神经再生。癫痫发作后大脑神经元死亡〔17〕,会启动炎症反应以恢复组织稳态并清除死细胞,而BDNF具有抵消各种炎症细胞因子的抗炎作用〔18〕。在毛果芸香碱诱导癫痫发作后,BDNF会增加被认为是大脑的一种防御机制,以防止神经元退化。然而,这种机制不足以保护神经元损伤。本研究表明,CREB激活引起BDNF上调,保护大脑免受癫痫损伤。

综上,豨莶草总黄酮可通过激活CREB/BDNF信号通路,抑制神经炎症和氧化应激,减少神经元凋亡,从而保护SE大鼠海马神经组织。因此本文推测豨莶草总黄酮可能成为治疗癫痫的一种新药物,然而,关于豨莶草总黄酮对SE大鼠的其他作用机制仍有待进一步研究。