基于基因片段和形态特征分析的山西鬼笔属物种多样性分析

张泽乾 ，毛 宁 ，刘 虹

（1.山西农业大学 山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2.首都师范大学 生命科学学院，北京 100048）

鬼笔属Phallus是一类形态特征独特、子实体质地海绵状、气味浓郁的大型真菌，分类上隶属于伞菌纲（Agaricomycetes）鬼笔亚纲（Phallomycetidas）鬼笔目（Phallales）鬼笔科（Phallaceae）。早期基于形态特征的分类学将鬼笔类真菌分为鬼笔属（Phallus）和竹荪属（Dictyophora），区别在于竹荪属孢托组织下沿有一个网格状裙子。现在的DNA分子研究显示，这2 个类群属于一个系统演化谱系，因此，Dictyophora被认为是Phallus的异名，其中的物种全部转移到鬼笔属。鬼笔属包括著名的商业食用菌品种竹荪Dictyophoraindusiata(Vent.Pers.)Fisch.，因此受到了广泛关注[1-4]。在分子系统研究出现之前，鬼笔属另外一个常见物种是白鬼笔，广布于世界各地，中国各地的白鬼笔几乎全部被鉴定为欧洲的P.impudicusL.，并以此名称出现在中国早期的所有菌类文献中[1-4]。然而，最近一项分子数据分析研究显示，中国分布的白鬼笔与欧洲的白鬼笔不是同一个物种，而是一个东亚地区特有的本土物种，并将其命名为冬荪Phallus dongsunT.H.Li et al.[5]，以区别于欧洲本土物种白鬼笔。白鬼笔是一种子实体中大型的珍稀食用真菌，在我国南部常见且已有人工培育产品，商品名称为白冬荪，是一种受欢迎的食用菌品种，其营养价值和风味口感与著名的竹荪相同。

鬼笔类真菌多数可以药用和食用，在世界范围内各大洲均广泛分布，我国鬼笔类真菌资源丰富，目前已报道有27 个种，主要分布在西南和华南地区[2-3]，北方地区分布较少。自2017 年开始，山西农业大学山西功能食品研究院野生菌团队连续在山西各地采集调查大型食用真菌物种多样性，在多地采到多份鬼笔类真菌样本，其中一个重要的发现是在山西南部中条山脉中部和东部区域发现2 种大型鬼笔，一种为白色，一种为黄色。白色鬼笔属于中国常见的白鬼笔（冬荪鬼笔），黄色样本颜色类似于黄脉鬼笔Phallus flavocostatusKreisel 和细鬼笔Phallus tenuis（E.Fisch.）Kuntz.[5-6]，但这2 种黄色的鬼笔子实体均为小型，除去颜色外，其他特征都明显不同。

为明确这种黄色鬼笔以及山西其他鬼笔类样本的准确分类学定位，本研究通过采用ITS 和LSU这2 个位点的基因片段进行建树分析，结合形态学特征，共鉴定出鬼笔属3 个物种，其中黄色样本被鉴定为冬荪鬼笔的黄色品种，这是黄色冬荪鬼笔在世界上首次发现，它的存在和发现为冬荪品种的人工驯化培育和育种提供了新的材料和理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

研究标本共8 份，其中黄色冬荪样本4 份，采集于我国北方山西省中条山脉和吕梁山脉中段关帝山。其中，中条山脉位于山西省南部，属暖温带季风大陆性气候，年平均温度12～14 °C，年降水量600～800 mm，最高点海拔为2 358 m，植被以油松（Pinus tabuliformisCarr.）、华山松（Pinus armandiiFranch.）、多种栎树（Quercusspp.）等为建群种的暖温带森林为主，局部有亚热带小环境区域，土壤类型自下而上依次为冲积土、山坡褐土、山地淋溶褐土和山地草甸土。吕梁山脉位于山西省西部大体呈南北走向，中段的关帝山属大陆性季风气候，年平均气温3.5 °C，年降水量830 mm，最高点海拔为2 831 m，土壤类型主要有山地棕壤、山地褐土、亚高山草甸土和洪泛平原草甸土，植被主要有华北落叶松（Larix principis-rupprechtiiMayr.）、云杉（Piceaspp.）、松树（Pinusspp.）、杨树（Populusspp.）、桦树（Betulaspp.）纯林或混交林等。

1.2 试验方法

1.2.1 形态特征鉴定 在野外采集标本并拍照记录，然后在40～50 °C 的干燥机中干燥。干燥后的标本保存在首都师范大学植物标本室（BJTC）和山西农业大学山西功能食品研究院植物标本室（HSA）。从新鲜标本中记录宏观特征，标准颜色值依据ColorHexa（http://www.colorhexa.com/）；将干燥样本手工切薄片放在含有3%氢氧化钾、刚果红、梅尔泽试剂[7]或乳酸棉蓝的载玻片上，加盖玻片在显微镜下观察微观特征。担孢子的尺寸使用“（a-）b-c（-d）”形式的符号表示。“b-c”范围至少包含90%的测量值。括号中给出了极值“a”和“d”。Q 为侧视图中担孢子的长宽比；Qav 是指所有担孢子的平均值Q，包括样品标准偏差。

1.2.2 DNA 提取、PCR 扩增和DNA 测序 本研究获得了ITS 和LSU 区域的序列。使用NuClean Plant Genomic DNA Kit（中国CWBIO）从山西省新采集的样本中提取基因组DNA。使用引物ITS1-F/ITS4 扩增ITS 区域（White et al.1990；Gardes &Bruns 1993）[8-9]，使用引物LR0R/LR5（Vilgalys &Hester 1990）[10]扩增28S 大亚基nrDNA（LSU）区域。PCR 反应体系25 µL：2 μL DNA 模板，上、下引物各1 µL（10 µmol/L），12.5 µL 2×Master Mix，8.5 μL ddH2O。PCR 反应程序：94 °C 变性5 min；94 °C 30 s，55 °C 45 s（ITS）/60 s（LSU），35 次循环；72 °C 1 min；72 ℃下延长10 min。将PCR 产物送至北京中科西林生物技术有限公司进行纯化、测序和编辑。验证合格的DNA 序列保存在GenBank数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），登录号如表1 所示。

表1 本研究引证的样本及其GenBank 登录号Tab.1 Specimens and their GenBank accession numbers in this study

1.2.3 系统发育分析 基于ITS-nrLSU 数据集进行系统发育分析。ITS 和LSU 序列数据包含：本研究从新标本提取测定的序列，一些重要文章先前使用的序列[5]，通过Blast 工具从GenBank 检索下载的一些相关序列。编辑ITS 和LSU 序列用于鉴定和研究山西省黄色鬼笔类物种的系统发育关系。在默认参数下，每个序列分别在MAFFT v.7.110 中对齐[11]，使用默认参数的Gblocks v.0.91b 识别对齐不佳的位点[12]，然后将对齐的ITS 和LSU 序列连接起来以进行进一步的系统发育分析。在进行系统发育分析之前，排除了所有确定的模糊位点，任氏蛇头菌Mutinus zenkeri被选作外类群。

使用参数未链接的GTRGAMMAI 替代模型（针对所有分区），使用RAxML 8.0.14[13-15]进行最大似然（ML）分析。使用快速引导分析搜索最简约的ML树，在RAxML 中计算ML 引导重复次数（1 000），ML 树用TreeView 32 生成[16]。自举值（BS）≥70%的进化分支被认为得到了大力支持[17]；贝叶斯法（BI）使用MrBayes v3.1.2[18]作为评估分支支持的附加方法。在BI 分析中，在选择由MrModeltest v2.3[19]确定的最佳替代模型GTR+I+G（用于ITS和nrLSU）后，使用默认设置，对10000000 代马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC）进行了2 次四链独立运行，每100 代采样一次。温度值降至0.20，老化设置为0.25，一旦分离频率的平均标准偏差达到0.01 以下，运行就会自动停止。构建70%多数规则共识树，用TreeView 32 生成进化树[16]，贝叶斯值（BPP）≥95%被认为得到了显著支持[20]。

2 结果与分析

2.1 分子系统发育

本研究中，新标本自测产生11 条ITS 和LSU序列。ITS-nrLSU 组合数据集矩阵包括来自12个分类单元的56条序列（ITS 29条，nrLSU 27条），包含1 445 个碱基（ITS 562 个，LSU 883 个）。本研究引用的相关分类群中，从山西省采集的所有黄色鬼笔标本都与包含有模式序列的白色冬荪鬼笔聚为同一个末端分支，并得到了强有力的支持（BS=99%，BPP=1.00）（图1），Blast 显示，该末端分支中每个标本的ITS 和LSU 序列的相似性都超过98.8%。结果表明，山西省采集的所有黄色鬼笔在系统发育上与白色的冬荪鬼笔属于同一个物种。

图1 基于ITS-nrLSU 序列的鬼笔属Phallus 系统发育树（ML）Fig.1 Phylogenetic tree of Phallus based on ITS-nrLSU sequences（ML）

2.2 形态分类结果

2.2.1 冬荪鬼笔Phallus dongsunT.H.Li，T.Li，Chun Y.Deng，W.Q.Deng &Zhu L.Yang，in Li，Li，Deng，Song，Deng &Yang，Phytotaxa443（1）：29（2020）

2.2.1.1 黄色品种形态特征 菌蛋近球形到卵圆形，50～70 mm×45～65 mm，灰白色头浅灰色，表面光滑，基部有白色菌索与土壤相联。外包被膜质，内包被胶质，无色。成熟子实体高145～250 mm，直径30～50 mm。孢托钟形到近圆锥形，淡黄色、黄色到橙黄色，长45～65 mm，直径30～48 mm，表面不规则深网格状，网眼深4～7 mm，顶部钝圆或平截，具一个3～5 mm 的椭圆或近圆形小孔，初期被绿色产孢组织完全覆盖。产孢组织橄榄绿色，黏。假柄柱状或棒状，通常向顶部渐细、向基部变粗，长150～200 mm，粗40～60 mm，淡黄色或黄色，海绵质，中空，壁厚5～8 mm，表面具直径1～3 mm 的不规则小腔。菌托卵圆形，高40～55 mm，直径30～40 mm，表面平滑或微皱，灰白色偶然浅灰色。菌索白色，直径1～2 mm，长可达50 mm（图2、3）。气味恶臭，味道没有记录。

图2 黄色冬荪鬼笔的担子果Fig.2 Basidiomata of yellow Phallus dongsun

图3 山西黄色冬荪鬼笔的显微镜特征Fig.3 Microscopic characteristics of yellow Phallus dongsun

担孢子长椭圆形或稍呈圆柱状，4.4～5.2 μm×1.9～2.5 μm，Q=1.92～2.27，Qm=2.12，无色，非淀粉质，薄壁，光滑，内含一个油滴。孢托组织由膨大的菌丝和间杂的球形或不规则球形的细胞组成，薄壁，无色，直径5.0～7.5 μm。假柄拟薄壁组织型，细胞球形或近球形，直径10～25 μm。菌托菌丝直径3.0～7.5 μm，分隔，薄壁，具锁状联合。菌索菌丝直径3.0～11.0 μm，薄壁，分隔，含分枝，具锁状联合。

习性、生境和分布：单生、散生或群生，松树（Pinusspp.）、栎树（Quercussp.）或杨树（Populussp.）纯林或混交林下地上。已知分布于我国山西省。

标本：山西省方山县麻地会乡关帝山，杨树Populussp.林地上，2018年8月31日，曹晋忠，LH329（HSA329）；翼城县中条山脉历山松树沟，松树Pinussp.林地上，2018 年9 月10 日，刘虹，LH511（HSA511）；翼城县中条山脉历山松树沟，松树Pinussp.林地上，2019 年8 月26 日，刘虹，LH1409（BJTC FM1546）；夏县泗交镇栎树Quercussp.林地上，2020 年10 月6 日，毛宁，MN083（FANM1607 BJTC）。

2.2.1.2 白色品种特征 菌蛋近球形到卵圆形，45～75 mm×42～68 mm，污白色、白色、灰白色头浅灰色，表面光滑，基部有白色菌索与土壤相联。外包被膜质，内包被胶质，无色。成熟子实体高140～260 mm，直径35～50 mm。孢托钟形到近圆锥形，白色，长43～67 mm，直径32～46 mm，表面不规则深网格状，网眼深4～6 mm，顶部钝圆或平截，具一个3～5 mm 的椭圆或近圆形小孔，初期被绿色产孢组织完全覆盖。产孢组织橄榄绿色，黏。假柄柱状或棒状，通常向顶部渐细、向基部变粗，长150～220 mm，粗41～63 mm，白色，海绵质，中空，壁厚5～8 mm，表面具直径1～3 mm 的不规则小腔。菌托卵圆形，高41～55 mm，直径32～41 mm，表面平滑或微皱，灰白色偶然浅灰色。菌索白色，直径1～2 mm，长可达55 mm（图4）。气味恶臭，味道没有记录。

担孢子长椭圆形或稍呈圆柱状，4.0～5.5 μm×1.8～2.5 μm，无色，非淀粉质，薄壁，光滑，内含一个油滴。孢托组织由膨大的菌丝和间杂的球形或不规则球形的细胞组成，薄壁，无色，直径5.0～7.5 μm。假柄拟薄壁组织型，细胞球形或近球形，直径10～25 μm。菌托菌丝直径3.0～7.5 μm，分隔，薄壁，具锁状联合。菌索菌丝直径3.0～10 μm，薄壁，分隔，含分枝，具锁状联合。

习性、生境和分布：单生、散生或群生，多种针叶林或阔叶林纯林或混交林下地上。已知分布于我国南北各地。冬荪鬼笔白色品种形态特征和黄色品种区别为孢托和假柄为白色。

标本：山西省翼城县中条山脉历山松树沟，松树Pinussp.林地上，2018 年9 月10 日，刘虹，LH504（HSA504）；翼城县中条山脉历山松树沟，松树Pinussp.林地上，2019 年9 月10 日，刘虹，LH444（HSA444）。

2.2.2 红鬼笔Phallus rugulosus（E.Fisch.）Lloyd，Mycol.Writ.（Cincinnati）2（Letter 31）∶402（1908）菌蛋卵圆形或蛋形，白色或灰白色，基部具白色或灰白色根状菌索。成熟后菌蛋顶部破裂，孢托组织由假柄支撑伸出，总高100～210 mm，直径20～30 mm。孢托钟形或圆锥形，红色，高15～39 mm，直径10～20 mm，顶部有一小孔，表面被有橄榄色孢子黏液。假柄圆柱状，海绵质，长60～130 mm，直径10～20 mm，上部浅红色，向下渐成白色或灰白色，表面有蜂窝状小孔。菌托包状或袋状。气味恶臭。担孢子椭圆形，无色，3.5～4.5 μm×1.5～2.0 μm（图5）。

图5 红鬼笔的担子果Fig.5 Basidiomata of Phallus rugulosus

习性、生境和分布：单生、散生或群生，多种林下地上。已知分布于我国南北各地。

标本：山西省沁水县土沃乡上沃泉村，杨树Populussp.林地上，2018年9 月10 日，刘虹，LH1188（BJTC FANM1132）。

2.2.3 超短裙鬼笔Phallus ultraduplicatusX.D.Yu，W.Lv，S.X.Lv，Xu H.Chen &Qin Wang，in Adamčík et al.，Cryptog.Mycol.36（2）：147（2015）菌蛋近球形，白色或灰白色，65～80 mm×70～80 mm，基部具白色或灰白色根状菌索。成熟后菌蛋顶部破裂，孢托组织由假柄支撑伸出，总高150～230 mm。孢托钟形或圆锥形，白色或黄白色，高35～50 mm，直径20～30 mm，顶部有一小孔，深网格状，表面被有橄榄色孢子黏液。菌裙白色，长20～40 mm，海绵质，具多角形网眼。假柄圆柱状，海绵质，长100～190 mm，直径20～35 mm，白色或浅黄白色，表面有蜂窝状小孔。菌托包状或袋状。气味恶臭。担孢子椭圆形，无色，4.0～5.1 μm×1.5～2.0 μm（图6）。

图6 超短裙鬼笔的担子果Fig.6 Basidiomata of Phallus ultraduplicatus

习性、生境和分布：单生、散生或群生，针叶林下地上。已知分布于山西和中国北部地区。

标本：山西省交城县关帝山庞泉沟，云杉Piceasp.林地上，2018年8月31日，刘虹，LH314和LH315；兴县黑茶山，油松Pinus tabulifornis林地上，2018 年9 月6 日，李素玲，LH376。

3 结论与讨论

冬荪鬼笔在我国南部贵州、云南地区是一种常被当地人采集食用，并已被人工培育的食用蘑菇物种[5]。本研究基于ITS 和LSU 联合分析证实，山西分布的大型黄色鬼笔在分类学上属于冬荪鬼笔Phallus dongsun，尽管它的子实体颜色与典型的冬荪鬼笔有所不同。同一物种具有不同颜色的现象在大型菌类中并不罕见，如生长在落叶松林下的厚环乳牛肝Suillus grevillei（Klotzsch）Singer 典型的子实体颜色为红褐色，但是黄色的类型并不罕见[21]，再如白灰乳菇Lactarius albidocinereus子实体有白色和灰色2 种类型[22]，作者在山西多年采集发现这个物种的2 种颜色个体在山西均有发生，其中灰色子实体的品种在山西南部更为多见。

本研究共发现有3个鬼笔属Phallus物种在山西的分布得到了数据支持，即冬荪鬼笔P.dongsun（包括白色和黄色2 个类型）、红鬼笔P.rugulosus和超短裙鬼笔（超短裙竹荪）P.ultraduplicatus。其中，冬荪鬼笔的白色类型仅见于山西南部的中条山脉，黄色的类型除中条山外，还在吕梁山脉中北部的关帝山杨树林下有分布。红鬼笔见于中条山脉东段的历山区域，而超短裙鬼笔分布于吕梁山脉的关帝山和黑茶山的云杉Piceasp.和油松林下。本研究是首次在自然界发现冬荪鬼笔有野生黄色品种存在，这对冬荪鬼笔的人工培育和育种增加了新的选择。食用黄冬荪野生驯化、生物学特性及其栽培条件是否与白色冬荪一致，还有待于进一步探索研究。