MicroRNA-101对肺尘埃沉着病肺纤维化影响的研究*

黄 健,汪 涛,苏盈笑,洪 炳△

江西省胸科医院:1.呼吸与危重症医学科;2.麻醉科,江西南昌 330006

肺尘埃沉着病是一种不可逆的职业病,由于患者长期吸入大量游离的二氧化硅(SiO2)粉尘导致肺部出现广泛结节性纤维化病变[1]。数据显示,我国至今肺尘埃沉着病患者累计超70万人[2]。肺尘埃沉着病患者的预后情况都较差,因此找寻新的治疗方向成为当今的研究热点。研究显示,microRNA(miRNA)可通过调控相关的信号通路,参与到纤维化的过程中[3],本研究在此基础上,进行细胞实验,通过观察相关指标水平在不同对照实验组的变化,研究miRNA-101(miR-101)在延缓肺尘埃沉着病肺纤维化中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 SPF级健康成年雄性C57BL/6小鼠18只,2月龄,体质量20～25 g,购自南昌大学医学院动物中心。

1.2仪器与试剂 Olympus光学显微镜(Olympus 公司),Forma 311CO2细胞培养箱、ECO0.9超净工作台、Siemens低温-80 ℃冰柜、低温离心机(美国Thermo公司),4 ℃冰箱及-20 ℃冰箱(德国Siemens公司)、DYY-7C Western电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、SPL-250电热恒温水浴锅(北京泰瑞有限公司);兔抗鼠Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)抗体(GeneTex公司),羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗体(碧云天生物技术公司),RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(上海贝博生物公司);SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒(庄盟生物公司);BCA蛋白定量试剂盒(北京百莱公司),SiO2粉尘(Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1肺尘埃沉着病小鼠的构建 将18只雄性C57BL/6小鼠均分为空白对照组、生理盐水组及SiO2组,各组小鼠称体质量后,用75%乙醇消毒,钝性分离皮肤,逐层暴露气管。生理盐水组、SiO2组分别使用微量注射器吸取50 μL生理盐水或SiO2粉尘混悬液后,经两气管软骨环间隙朝向心端刺入气管,空白对照组小鼠只做假手术处理。待动物清醒后,常规饲养。

1.3.2小鼠肺组织形态 各组小鼠处死后留取肺组织,取部分肺组织采用4%的多聚甲醛固定24 h,经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋等步骤后,以5 ?m厚度连续切片,HE染色后,采用光学显微镜观察各组小鼠肺组织形态。

1.3.3小鼠肺组织miR-101表达水平检测 小鼠处死后留取肺组织,通过实时定量PCR检测各组小鼠肺组织中miR-101的表达水平。

1.3.4小鼠肺组织Col I表达水平检测 采用RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂预混液裂解细胞,将上清液置于-80 ℃保存,采用蛋白质印迹法对蛋白质进行定量检测,各组细胞的蛋白样品通过SDS-PSGE凝胶电泳进行分离。PVDF 膜恒流200 mA进行转模,转膜结束用考马斯亮蓝染色液观察凝胶中蛋白转移情况。用丽春红染色液对PVDF膜进行染色,膜上有粉红色条带表明蛋白转移成功。使用TBST缓冲液漂洗干净,进行免疫检测,5%脱脂奶粉封闭膜,4 ℃过夜。按照兔抗鼠一抗说明书配制好反应液,孵育2 h。TBST 缓冲液漂洗3次,按照羊抗兔二抗说明书配制好二抗反应液,孵育2 h。TBST缓冲液洗膜3次,显色后上机采图。应用ImageLab医学图像分析软件对蛋白质印迹所表达的条带进行半定量检测,用平均光密度(A)表示。框取各泳道蛋白,对照彩色Marker分层及相应的分子量标记,测出A,目的蛋白A/大鼠β肌动蛋白(β-actin)A。

1.4检测指标 (1)比较各组小鼠肺组织形态学变化;(2)比较各组小鼠肺组织的miR-101和ColⅠ蛋白表达水平。

2 结 果

2.1肺尘埃沉着病小鼠的构建情况 SiO2组在28 d形成肺尘埃沉着病模型。空白对照组及生理盐水组小鼠肺组织结构完整,肺泡间隔均匀,无间质纤维组织增生。SiO2组小鼠肺部组织发生纤维化,肺部结构被破坏,肺间质和肺泡内有大量的细胞浸润,并且伴有炎症反应,血管壁增厚。

2.2肺尘埃沉着病小鼠肺组织形态学改变 空白对照组及生理盐水组肺泡结构正常,肺泡壁薄;SiO2组肺泡间隔增宽,肺泡壁增厚,结构塌陷,纤维细胞和肉芽肿明显,炎症细胞大量浸润,肺间质实变充血,残存少量正常肺泡。见图1。

注:A为空白对照组;B为生理盐水组;C为SiO2组。

2.3三组小鼠肺组织的miR-101和ColⅠ蛋白表达水平比较 生理盐水组肺组织的miR-101和ColⅠ蛋白表达水平与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。SiO2组的miR-101表达水平低于空白对照组,而ColⅠ蛋白水平高于空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组肺尘埃沉着病小鼠肺组织的miR-101和ColⅠ蛋白表达水平比较

3 讨 论

肺尘埃沉着病是我国目前危害最严重和造成严重社会影响的职业病。肺尘埃沉着病的肺纤维化涉及大量细胞因子及细胞因子形成的复杂网络系统。近年来发现miRNA可以靶向作用于相关的信号传导通路[4-5],对组织纤维化的发生、发展起到重要作用。国外研究表明miR-101在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中表达下调,可抑制成纤维细胞活化[6-8]。目前已知肺尘埃沉着病的病理改变包括结节、弥漫性纤维化、尘斑,但肺纤维化发病机制较为复杂尚未完全明确[9-12]。肺纤维化是由于各类刺激导致的肺泡上皮细胞损伤,进一步与成纤维细胞作用,在肺损伤区域出现肺成纤维细胞细胞累积,肺成纤维细胞灶从而形成[13]。

SiO2进入肺组织后,能够激活细胞自噬,进而释放大量炎症细胞因子,造成持续性循环信号错误传导,导致级联放大效应,造成不可逆的肺组织损伤,致使患者生存质量下降。HE染色后观察各组小鼠肺组织形态学改变发现,空白对照组及生理盐水对照组肺泡结构正常,肺泡壁薄;SiO2模型组肺泡间隔增宽,肺泡壁增厚,结构塌陷,纤维细胞和肉芽肿明显,炎症细胞大量浸润,肺间质实变充血,残存少量正常肺泡,提示SiO2干预后肺组织损伤严重。

miRNA是一类内源基因编码的非编码单链RNA分子,可对基因表达进行调控。miR-101过表达可以减轻心肌梗死后心肌纤维化,也可作为其他器官纤维化疾病潜在治疗靶点。本研究结果表明,SiO2组的miR-101表达水平低于空白对照组(P<0.05),提示miR-101是一种负性调控因子,在肺尘埃沉着病纤维化中发挥了同样的作用。本研究结果显示,空白对照组与生理盐水对照组小鼠肺组织的miR-101和Col I表达水平比较,差异无统计学差异(P>0.05),而SiO2组的miR-101表达水平显著降低,Col I蛋白水平则显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),表明SiO2粉尘能够激活肺纤维化细胞,使ColⅠ蛋白表达水平明显升高,提示有大量成纤维细胞发生了转化,而miR-101可改善SiO2粉尘诱导的肺纤维化。既往研究表明,miR-101是一种抗纤维化的microRNA[14],与本研究结果一致。

综上所述,miR-101的特异性表达抑制了肺纤维化的发病过程,调控miR-101可作为肺纤维化治疗的有效方法,为肺纤维化的临床诊断和治疗提供新的依据和方向。