卓资熏鸡致腐菌群多样性分析

杨茹艳，李春雨，郭亚男，高 丽，王利利

（包头师范学院生物科学与技术学院，内蒙古 包头 014030）

由微生物引起的食品腐败和污染是全球食品工业面临的主要问题，也是各国政府对食品质量安全与食品供应保障的关注焦点[1]。据世界卫生组（WHO） 报告，每年全世界约25%的食品损失是由于微生物腐败造成的，不但给生产者带来巨大经济压力，还加重了社会的环境负担[2-4]。卓资熏鸡是内蒙古自治区乌兰察布市卓资县的传统名特禽美食，曾被誉为全国“三大名鸡”之一，以其个大体肥、色泽红润、味道鲜美、肉质细嫩而深受消费者喜爱[5]。为保证消费者健康，对其微生物控制变得尤为重要。由于熏鸡具有丰富的蛋白质、脂类等营养成分，其环境非常适宜微生物的生长繁殖，因此也极易在贮藏过程中引起腐败变质，导致熏鸡的色、香、味等感官异常，甚至产生组胺、亚硝酸盐等有害物质，极大地降低了卓资熏鸡的市场形象[6]。因此，探究卓资熏鸡腐败期间致腐菌群多样性是控制细菌繁殖、延长货架期的基础。

目前在食品腐败方面，国内外已开展了很多相关的研究，如李洁等人[7]运用了形态学和生理生化鉴定的方法，发现引起半干面腐败的致腐菌主要是芽孢杆菌属和葡萄球菌属，张春江等人[8]运用了微生物菌落计数方法监测扒鸡在加工过程中优势致腐菌群的变化等，采用的方法大多是传统的微生物分离、生化鉴定等。该方法虽然简便易操作，但会受到可培养的条件限制，分析的结果不能完全反映样品中微生物群落情况。近年来，随着高通量测序技术的迅速发展，关于食品中腐败微生物的研究方法逐渐增多，尤其是以16S rRNA 高通量测序最为典型，是近年研究菌群多样性的新手段。其特点是信息量大、效率高，能够更加准确、全面反映样本的微生物群落结构，因此该技术已经广泛应用于微生物群落组成的分析[9]。如宋相宇等人[10]采用高通量测序技术探究不同包装及储存温度对白切鸡中微生物菌群结构的影响，发现白切鸡优势菌属为假单胞菌属。顾春涛等人[11]运用16S rRNA 高通量测序技术结合微生物培养分析冷鲜牛肉中的致腐菌群多样性变化等。

利用16S rRNA 高通量测序技术快速分析食品中微生物菌群结构已成功应用于猪肉、鸡肉等生鲜肉品中，而对于肉制品，尤其是熏鸡制品的研究较少，对其致腐菌群结构分析较少[12-14]。基于此，首次以当地传统特色美食卓资熏鸡为研究对象，结合高通量测序技术分析腐败过程细菌菌群组成及多样性变化，意在分析导致熏鸡腐败的优势菌群，为熏鸡制品的加工、贮藏过程中有针对性地控制微生物污染提供借鉴和参考，并且为下一步防腐保鲜提供可用的方法，从而能更好地将当地特色卓资熏鸡制品推广销售至全国，拓展销路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

熏鸡，购自内蒙古自治区包头市青山区张金涛熏鸡总店；DNA 提取试剂盒及凝胶回收试剂盒，北京天根公司提供。

1.2 仪器与设备

超净工作台（HDL APPARATUS）、冰箱（Haier BCD-190TMPK）、称量天平（Sartorius BS224S）、高速冷冻离心机（TECHCOMP CT14RD）、PCR 仪（Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler） 等。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集

将购买回来的新鲜熏鸡分成大小均匀的小块分装于灭菌的铝制盒中，室温下存放在实验室超净工作台中等待其腐败变质。

1.3.2 样品的预处理

将放置2，5 d 后的腐败熏鸡样品分别置于灭菌的研钵中充分研磨捣碎，分别称取5 g 溶解于100 mL无菌水中制备成菌悬液，即获得腐败早期样品（day2）和腐败中期样品（day5）。为了减少试验误差，每个处理组设置3 个平行重复样品。

1.3.3 DNA 提取及测序

按照试剂盒说明书操作提取样品总DNA，利用引物341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') 和805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')扩增细菌16S rRNA 基因的V3-V4 高变区，然后使用DNA 凝胶回收试剂盒对PCR 产物进行纯化，定量后送去百迈克生物公司进行高通量测序。

1.4 数据处理与分析

首先将Illumina PE250 平台测序得到的PE reads根据overlap 关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，高质量序列以97%的序列同一性聚类为可操作的分类单位（OUT）。利用QIIME 对OTU 进行测序深度的检测及物种多样性指数分析；利用RDP Classifier 方法和GreenGene 数据库进行物种分类学信息分析；利用LEfSe 分析组间显著差异的物种；采用KEGG 预测细菌功能。

2 结果与分析

2.1 序列信息统计

熏鸡腐败过程中细菌群落的稀释曲线（a） 和Shannon-Wiener 多样性曲线（b） 见图1。

图1 熏鸡腐败过程中细菌群落的稀释曲线（a） 和Shannon-Wiener 多样性曲线（b）

从样本中共获得了62 884～74 974 条有效序列（平均长度429 bp）。在97%的序列相似度水平下，总共获得了225 个OTU，其中每个样本的平均OTU数为125±7。这些OTU 被分为11 个门，19 个纲，23 个目，61 个科和128 个属。稀疏曲线可以反映样品的取样深度，如图1（a） 随着测序深度的增加，各样本的稀释度逐渐趋于平缓，表明此次测序能够反映样本中微生物的多样性，并且Shannon-Wiener多样性曲线图1（b） 显示随着测序数量增多，曲线趋向平坦，说明测序数据量合理，可以反映样品中绝大多数的微生物实际情况。

熏鸡腐败过程中细菌群落在OTUs（a）、门（b）和属（c） 水平下的韦恩图见图2。

图2 熏鸡腐败过程中细菌群落在OTUs（a）、门（b） 和属（c） 水平下的韦恩图

在OTU 水平上，腐败早期（day2） 和腐败中期（day5） 样本共有OTU 为138 个，而早期特有的OTU 为47 个，中期特有的OTU 为42 个（图2（a））；在门水平上，2 个时期样本共有门为10 个，而特有的门只有1 个存在于腐败中期样品中（图2（b））；在属水平上，2 个时期样本共有属为73 个，而早期特有的属为30 个，中期特有的属为25 个（图2（c）），表明了腐败早、中期样品群落组成存在差异。

2.2 a 多样性和β 多样性分析

熏鸡腐败过程中细菌群落的α 多样性分析见图3。

图3 熏鸡腐败过程中细菌群落的α 多样性分析

采用α 多样性指标Chao1、ACE 和Shannon 指数分析不同腐败时期细菌群落分布的丰富度和多样性。腐败早期（day2） 和腐败中期（day5） 样本中细菌的α 多样性指数除了Chao1 指数（157.215 9±36.47 和176.536 8±43.87，p=0.28） 差异不明显外，其他指数ACE 指数（157.778 7±32.64 和202.737 4±37.69，p=0.042） 和Shannon 指数（2.388 7±1.45 和3.443 4±0.78，p=0.002 9） 均显示存在显著差异，表明了不同腐败时期样品中的细菌群落在丰富度和多样性上存在差异，且腐败中期菌群的丰富度和多样性较高。

采用β 多样性分析来确定不同腐败时期细菌群落组成是否存在差异，使用非加权UniFrac 距离的非度量多维尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS） 制作散点图。

熏鸡腐败过程中细菌群落的NMDS 分析图见图4。

图4 熏鸡腐败过程中细菌群落的NMDS 分析图

同时期的腐败样品存在聚类趋势，而不同时期腐败样品组间存在明显差异，表明不同腐败时期样本之间的细菌群落组成存在显著差异。

2.3 不同腐败时期细菌群落组成分析

为了分析腐败过程中主要细菌群落组成的动态变化，选取样本中丰度大于1%的细菌进行聚集信息统计。

熏鸡腐败过程中细菌群落在在门（a） 和属（b）水平物种丰度柱状图见图5。

图5 熏鸡腐败过程中细菌群落在在门（a） 和属（b） 水平物种丰度柱状图

基于门水平的分析结果如图5（a），各组样本共鉴定出9 个门，其中平均相对丰度大于1%的菌门有厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria），前2 个门在每个样本中都占主导地位，平均累积占比可达97.72%，说明熏鸡腐败过程的绝对优势菌门为厚壁菌门和变形菌门。同时发现随着腐败时间的变化，细菌群落的丰度在门水平上呈现动态变化，从早期变形菌门为主变成了中期以厚壁菌门为主，早期放线菌门丰度仅占0.02%到中期上升至4.27%。

基于属水平的分析结果如图5（b），各组样本共鉴定出74 个属，其中平均相对丰度大于1%的菌属有7 个，为不动杆菌属（Acinetobacter）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、未经培养的肠杆菌属细菌（Uncultured Bacterium f Enterobacteriaceae）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、巨球菌属（Macrococcus） 和谷氨酸杆菌属（Glutamicibacter）。其中，前4 个属在每个样本中都占主导地位，平均累积占比为82.09%，说明熏鸡腐败过程的优势菌属为不动杆菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属和未经培养的肠杆菌属细菌。同时发现在腐败过程中细菌的相对丰度在属水平上变化更加明显：从早期以不动杆菌属占比最高变成了中期以葡萄球菌属占比最高，早期的巨球菌属（丰度9.27%） 也被中期的赖氨酸芽孢杆菌属（丰度17.02%） 和谷氨酸杆菌属（丰度3.60%） 取代成为新的优势腐败菌属。

2.4 不同腐败时期细菌群落组间差异分析

使用LEfSe 分析腐败早期（day2） 及中期（day5）样品之间细菌组成的差异性。

熏鸡腐败过程中细菌群落组间LEfSe 差异分析统计见图6。

图6 熏鸡腐败过程中细菌群落组间LEfSe 差异分析统计

在门水平上腐败早、中期之间差异显著的微生物有4 个，腐败早期样品中相对丰度较高的差异物种是变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidete），腐败中期样品中相对丰度较高的差异物种是厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria） （LDA＞2.0，p＜0.05）。在属水平上腐败早、中时期之间差异显著的微生物有23 个，腐败早期样品中相对丰度较高的差异物种是不动杆菌属（Acinetobacter）、巨球菌属（Macrococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、肠球菌属（Enterococcus）、普雷沃菌属（Prevotella）、产粪甾醇真细菌（Eubacterium coprostanoligenes group）、盐单胞菌（Halomonas）、拟杆菌属（Bacteroides） 等共9 个，腐败中期样品中相对丰度较高的差异物种是赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、未经培养的肠杆菌属细菌（Uncultured Bacterium f Enterobacteriaceae）、谷氨酸杆菌属（Glutamicibacter）、乳球菌属（Lactococcus）、棒杆菌属（Corynebacterium）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、罗氏菌属（Rothia）、考克氏菌属（Kocuria）、微球菌属（Micrococcus） 等共18 个。

2.5 不同腐败时期细菌群落功能预测分析

利用KEGG 数据库对不同腐败时期细菌群落功能进行预测。

熏鸡腐败过程中细菌群落功能预测KEGG 图见图7。

图7 熏鸡腐败过程中细菌群落功能预测KEGG 图

从组成上看，腐败早期（day2） 和中期（day5）样品中的细菌群落参与代谢途径基本相同，可归为七大类，包括遗传信息处理（Genetic Information Processing）、生物体系统（Organismal Systems）、代谢（Metabolism）、人类疾病（Human Diseases）、细胞过程（Cellular Processes）、环境信息处理（Environmental Information Processing） 和 未 分 类 的 功 能（Other）；从丰度上看，代谢是腐败过程中细菌的主要功能，其次为环境信息处理和遗传信息处理，体现了微生物应对环境变化的基因调控功能（图7（a））。随后比较腐败早、中期组间菌群在代谢途径上的变化和差异（图7（b）），除未分类的功能外，其他六大类代谢通路均具有显著差异（p＜0.05），推测主要与菌落结构发生更替与丰度变化有关。

3 讨论

卓资熏鸡作为内蒙古中西部地区的传统名食，已有近百年的历史，是人们喜爱的熏肉制品[15]。其通过传统的配方调制和特殊的卤制、熏制工艺，使熏鸡在具有独特风味的同时也极大地降低了微生物浓度，起到很好地防腐作用[16]。但在熏鸡后期贮藏、销售、运输等环节又很容易受到微生物污染，而微生物污染是食品腐败变质的主要原因。

目前，关于鸡肉类食品中腐败菌研究多集中在冰鲜鸡肉上，如赖宏刚等人[17]发现冷鲜鸡的腐败菌以假单胞菌、乳酸菌为主，而在鸡肉制品上研究较少，只有关于一些卤鸡制品的研究，如汤敏等人[18]发现冷藏过程中的德州扒鸡主要腐败菌为假单胞菌属、肠杆菌属、葡萄球菌属等，对熏鸡制品腐败菌的研究报道更是很少。因此，利用高通量测序技术首次对卓资熏鸡致腐菌群多样性进行研究，发现在腐败过程中丰度较高的2 个门：厚壁菌门和变形菌门，以及4 种优势致腐菌：不动杆菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属和未经培养的肠杆菌属，而在以往的研究中发现这些菌多见于肉类食品中[19-22]。值得注意的是在研究中发现的假单胞菌属丰度极低，可能是由于不同温度导致样品腐败的优势腐败菌不同[23]。同时，在腐败过程中还发现一些病原菌，如肠球菌属、普雷沃菌属、拟杆菌属、棒杆菌属、罗氏菌属等，因此加强微生物控制，保证食品安全是十分重要的。

随后探究熏鸡腐败过程中细菌群落的动态变化，发现不同腐败时期的菌群组成及多样性存在显著差异，可能原因是随着腐败时间的延长，微生物也在不断适应新环境，一些优势细菌易适应环境而大量繁殖，在数量与比例上占绝对优势，而一些细菌所占比例减少或不再繁殖。随后针对其中腐败早、中期菌群的差异物种进行分析，发现在腐败早期相对丰度较高的差异菌，如巨球型菌属、魏斯菌属、肠球菌属、普雷沃菌属、拟杆菌属等均是厌氧菌，到了腐败中期这些菌可能由于好氧菌的大量繁殖被竞争抑制，相对丰度下降；而相应的腐败中期相对丰度较高的差异菌多为好氧菌，如赖氨酸芽孢杆菌属、谷氨酸棒状杆菌属、罗氏菌属、考克氏菌属、棒杆菌属、微球菌属等。其中，赖氨酸芽孢杆菌属和谷氨酸棒杆菌属变化最显著，以往研究发现这些菌多存在于泡菜发酵中，在腐败过程中会产生不同类型的有机酸、挥发性气体等，造成食物气味、颜色等异常，且更能适应后期变质后的生存环境[24-27]。由于腐败过程中菌落组成及丰度存在动态变化，相应的菌群功能会发生差异性变化。利用KEGG 数据库对腐败早、中期细菌群落功能进行预测，发现绝大多数的细菌参与了代谢（Metabolism） 这一类别，说明在腐败过程尽管细菌群落会发生改变，但是其主要功能通过代谢实现的。

4 结论

综上所述，采用16S rRNA 高通量测序技术对卓资熏鸡腐败过程中致腐菌群组成及多样性进行研究。结果共获得225 个操作分类单元（OUTs），分为11个门、128 个属，其中鉴定出了2 个绝对优势的致腐菌门（厚壁菌门和变形菌门） 和4 个绝对优势的致腐菌属（不动杆菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属和未经培养的肠杆菌属）。α、β 多样性显示不同腐败时期的细菌菌群组成及多样性存在显著差异；对其中腐败早、中期样品进行LEfSe 组间差异分析，发现在门水平上差异显著的细菌有4 个，在属水平差异显著的细菌有23 个；利用KEGG 数据库对腐败早、中期细菌群落功能进行预测，发现代谢是腐败过程中细菌最主要功能，且2 个时期的菌群在六大类代谢通路均具有显著差异，表明食物腐败过程中细菌群落结构、组成及功能存在相应的变化，呈现出一定的演替规律。评估了卓资熏鸡腐败过程中细菌种类的多样性及动态变化，为熏鸡制品的加工、贮藏过程中有针对性地控制微生物污染提供借鉴和参考。