几种食用菌胞外降解酶的研究进展

王静蕾,祝国强,陈毅凡,王红艳

(中国农业大学 烟台研究院,山东 烟台 264670)

0 引言

近年来,我国食用菌产业发展迅速,产量由1978年的5.8 万t提高至2020年的4 016.43万t,已成为我国继粮、油、蔬、果后的第5大种植业[1]。食用菌属异养型生物,营腐生或寄生生活,生长发育过程中依靠自身分泌的胞外酶分解外界的有机物而获得营养。野生食用菌多以腐木和腐叶等作为营养来源,人工栽培的食用菌多以木屑、棉籽壳、秸秆和麦麸[2]等作为栽培基质,其中含有大量的纤维素、半纤维素、木质素和淀粉等天然高聚物质,可诱导食用菌分泌纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶和淀粉酶等多种胞外降解酶,在胞外酶的作用下对外源营养物质分解进而获得碳源和氮源[3]。因此,胞外降解酶在食用菌生长发育过程中起着至关重要的作用,胞外酶活力的高低直接决定食用菌对培养基料中营养物质的降解速率,影响食用菌对营养的吸收和利用速率,进一步影响食用菌的产量和品质。食用菌胞外酶的合成分泌主要受基因的控制,同时也受外界环境和自身代谢等因素的影响,因此,不同生长时期食用菌合成分泌的胞外酶种类和活力不尽相同。食用菌胞外降解酶主要有纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等,可分解基质中的纤维素、半纤维素、木质素、多糖和蛋白质等高分子物质,为食用菌的生长发育提供营养保障[4]。目前,关于食用菌胞外降解酶的种类、活性测定方法及其应用等已有大量的研究报道。为我国食用菌胞外降解酶的研究与应用提供参考,从食用菌的纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶和淀粉酶4种主要胞外酶的研究概况、测定方法和应用研究等方面进行概述。

1 食用菌胞外酶的种类

1.1 纤维素酶系

食用菌纤维素酶是降解纤维素生成短链葡聚糖、寡糖或葡萄糖的一组酶系,根据催化反应功能的不同分为内切葡聚糖酶(C1酶)、外切葡聚糖酶(Cx酶)和β-葡萄糖苷酶(BGL酶)。纤维素本身不溶于水,纤维素酶与纤维素难以形成酶-底物复合物(ES),因此需要借助纤维素酶的吸附作用形成复合物,在多种酶组分的协同作用下分解利用纤维素,为食用菌的生长提供碳源[4]。目前,有关食用菌胞外纤维素酶的研究多集中于不同食用菌品种的产纤维素酶能力、纤维素酶的筛选与鉴定和纤维素酶的活力提升方法等方面。丁玉萍等[5]研究表明,大白菇、金针菇、香菇、竹荪、磷盖红菇和杏鲍菇6种食用菌的产纤维素酶能力以磷盖红菇最强。DEBNATH等[6]通过控制物理和化学参数影响野生食用菌Pleurotusgiganteus胞外纤维素酶的活性,筛选出胞外纤维素酶活性最适条件为温度50 ℃、pH 5.0、底物浓度1.4%(羧甲基纤维素)和反应时间30 min。冯光志等[7]研究发现,锌能促进平菇胞外酶的分泌。

1.2 半纤维素酶系

食用菌半纤维素酶简称HC酶,为β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和α-葡萄糖醛酸酶等酶协同作用下而形成的酶系,能将半纤维素降解为木糖、阿拉伯糖和葡萄糖等单糖供菌丝体吸收利用。β-1,4-内切木聚糖酶和β-木糖苷酶是水解半纤维素的关键酶,木聚糖酶将木聚糖水解为低聚木糖,降低聚合度,木糖苷酶通过水解木寡糖的末端催化木糖残基的释放[8]。目前,有关食用菌胞外半纤维素酶的研究多集中于半纤维素酶活性方面,包括产酶能力以及产酶条件优化等。张红刚等[9]研究发现,在菌丝体阶段和现蕾前期喷施三十烷醇、3-吲哚乙酸、6-苄氨基嘌呤、赤霉素、萘乙酸和芸苔素内酯6种生长调节物质后白灵菇不同生长发育阶段半纤维素酶活性均有所提高,其中芸苔素内酯对半纤维素酶的影响最大。JURAK等[10]对从菌丝生长和子实体形成阶段的双孢蘑菇堆肥中提取的内切木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-木糖苷酶和β-葡聚糖酶的活性分析表明,4种酶均存在内切木聚糖酶和β-木聚糖酶的活性,以葡聚糖酶活性较小。张孔金等[11]研究富硒巴西蘑菇菌丝胞外酶活性发现,适当浓度的硒对半纤维素酶活性具有促进作用。

1.3 木质素降解酶系

食用菌木质素降解酶主要包括过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(LaC)。木质素过氧化物酶是木质素降解过程中的主要酶类,可在木质素聚合物内形成自由基,导致化学键稳定性变差从而破坏木质素大分子。锰过氧化物酶和漆酶同属于酚氧化酶。目前,有关食用菌胞外木质素降解酶的研究已有大量报道,其中漆酶研究开展较早,是所有木质素降解酶中研究最多的酶类,过氧化物酶也有学者进行一定的研究。李鹏等[12]采用双因素方差分析3个毛木耳菌株在木屑、玉米芯、棉籽壳和麦麸4种栽培基质下的产漆酶活性发现,毛木耳菌株中毛木耳781和玉木耳01分泌的漆酶活性最高,栽培基质中麦麸对毛木耳菌株产漆酶的诱导作用更强。张初署等[13]研究表明,食用菌SJ-1漆酶的最适反应pH为3.0,最适反应温度为35 ℃;Cu2+能够显著激活食用菌SJ-1漆酶的活性,而 Fe2+、Ca2+、Mg2+、Na+和K+对SJ-1漆酶活性具有不同程度的抑制作用。肖冬来等[14]研究发现,常见金属离子Ca2+、K+、Mn2+、Mg2+和Fe2+等对木质素过氧化物酶活性具有抑制作用,Na+对木质素过氧化物酶活性具有促进作用。

1.4 淀粉酶系

食用菌淀粉酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶的总称,能够分解淀粉糖苷键。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉和糖元等α-1,4-葡聚糖的α-1,4-糖苷键,水解生成葡萄糖、麦芽糖和含有α-1,6-糖苷键支链的糊精。目前,食用菌胞外淀粉酶的研究主要集中在活性方面,主要是探究不同条件变量下的淀粉酶活性。闫静等[15]对不同温度下秀珍菇胞外淀粉酶活性进行研究发现,相同处理温度下,随着处理时间延长,淀粉酶活性总体呈先升后降趋势。肇莹等[16]研究小麦、大米和柞蚕蛹3种栽培基质下蛹虫草胞外淀粉酶的活性及其与营养成分的相关性发现,小麦、柞蚕蛹和大米3种栽培基质胞外淀粉酶活性依次递减,且蛹虫草子实体中蛋白质的累积与淀粉酶活性呈极显著正相关。BEDADE等[17]在不同的碳源、pH和培养时间条件下对斑块块菌菌丝体进行液体深层发酵生产淀粉酶的最优条件为可溶性淀粉0.5% (w/v)、初始培养基pH 7.0和培养时间7 d,该条件下淀粉酶活力达1.41 U/mL,且该淀粉酶在pH 5.0和50 ℃时活性最强。

2 食用菌胞外酶活性的测定方法

2.1 定性分析

平板显色法是定性分析食用菌胞外酶活性的主要方法,具有显色快捷和操作简易特点,常用于从大量食用菌菌株中筛选产目标胞外酶的菌株,可为多种食用菌的产酶菌株筛选减少筛选工作量。平板显色法包括平板透明圈法和平板变色圈法,透明圈和变色圈的出现速度、直径大小以及变色圈的颜色深浅能够直接反映菌株与营养物质或指示剂等物质反应的能力,可初步判断菌株生成的胞外酶数量及活性[18]。平板透明圈法是指在固体栽培基质中加入营养物质,使试验菌株生成的特定胞外酶分解营养物质,在菌落周围产生透明圈[19]。如定性筛选产纤维素酶常用刚果红选择培养基,其原理是刚果红能与培养基中的纤维素(多糖)形成红色复合物,但刚果红并不与水解后的葡萄糖和纤维二糖形成复合物,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。徐源等[20]利用刚果红染色法对生产中常见的6个食用菌菌种进行高活性纤维素酶菌株筛选发现,鸡腿菇51的纤维素酶降解能力最强,平菇各品种其次,茶树菇TS1最弱。定性分析产半纤维素酶也常使用平板透明圈法,在培养基中添加木聚糖并用染色剂染色,木聚糖酶水解木聚糖后出现染色区和透明区,透明圈直径与酶量的对数呈正相关[21]。此外,定性筛选淀粉酶时,在含有淀粉的培养基中喷洒含碘染色剂,被染色的蓝色平板上会出现以产淀粉酶菌种为中心的透明圈。平板变色圈法是指在固体栽培基质中加入特定指示剂,使得实验菌株生成的胞外酶与指示剂发生显色反应[19]。如定性分析食用菌木质素酶主要采用平板变色圈法,漆酶(LaC)能使单宁酸转变为褐色物质,锰过氧化物酶(MnP)和Mn2+共同作用将愈创木酚氧化成棕红色有机物,木质素过氧化物酶(LiP)能使RB-亮蓝变为黄色,通过平板的变色情况定性分析菌株产木质素酶能力。高锋等[22]通过平板变色圈法,分别利用RB-亮蓝、单宁酸和愈创木酚为底物的培养基测定平菇、香菇和杏鲍菇中的木质素过氧化物酶、漆酶和锰过氧化物酶。

2.2 定量分析

2.2.1 纤维素酶活性 纤维素酶是复合酶,其定量分析方法可分为单一纤维素酶组分酶活力测定和纤维素酶总酶活力测定。单一纤维素酶组分活力测定的方法主要是羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)酶活性测定方法[23],纤维素酶作用于CMC-Na并将其分解为葡萄糖和纤维二糖等还原糖,DNS与还原糖反应生成红棕色化合物,以葡萄糖溶液为标准溶液,绘制还原糖浓度和吸光度的标准曲线,反应液颜色强度与还原糖含量成比例,利用比色法得到还原糖浓度,从而确定酶活力。

冯作山等[24]报道,白灵侧耳栽培过程中各生长发育阶段的羧甲基纤维素酶活性,以实体生长阶段第107 天时达最大值。纤维素酶总酶活力测定方法主要是滤纸酶活(FPA)测定方法,滤纸是聚合度中等的纤维素材料,纤维素酶将其水解后生成的还原糖量的多少反应酶活高低,通过加DNS试剂显色后的OD值得出具体酶活数值,该方法由于滤纸结构复杂,一般适用于酶活力较强的菌株[25]。赵长江等[26]采用羧甲基纤维素钠盐酶活性测定方法和滤纸酶活测定方法分别测定不同碳、氮源对猴头菌的单一纤维素酶活性和总酶活性得出,葡萄糖碳源和蛋白胨氮源下单一纤维素酶活性最强,葡萄糖碳源和苯丙氨酸氮源下总酶活性最强。此外,荧光定糖法也可用于酶活力的测定[23],该法利用纤维素水解产物还原糖与反应液反应生成荧光物质的荧光强度来表征酶活力,且其反应灵敏、迅速,适于较低酶浓度的测定。

2.2.2 半纤维素酶 半纤维素酶主要包括木聚糖酶和木糖苷酶。木聚糖酶和木糖苷酶的活性均采用分光光度计法测定,但显色原理有所不同。木聚糖酶的显色原理是木聚糖酶分解木聚糖生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)发生显色反应。而木糖苷酶的原理是利用硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)与木糖苷酶反应产生的对硝基苯酚(pPN)与Na2CO3反应显色[8]。马怀良等[27]采用DNS显色法测定猴头菌糠、平菇菌糠和滑子蘑菌糠中的木聚糖酶在不同pH和温度条件下的活性。林金盛等[28]采用pNPX测定了不同浓度MgSO4下草菇在含柠檬酸钠的PDB培养基中产生的木糖苷酶活性。

2.2.3 木质素降解酶 木质素降解酶活性的测定方法主要有分光光度计法、脉冲激光光声分析法、高效液相色谱法和极谱法等,主要用于漆酶、过氧化物酶和锰过氧化物酶活性的定量分析。其中,分光光度计法具有操作简单、测定迅速和仪器设备简易等特点,在木质素降解酶活性测定中应用较多,根据所测酶的种类不同选择不同的底物和缓冲溶液。测量漆酶活性常见的分光光度计法有ABTS法和愈创木酚法等,不同方法优缺点各异。ABTS法以ABTS作为底物,优点是漆酶对ABTS亲和力高,反应灵敏,但ABTS价格较高。愈创木酚法以愈创木酚为底物,价格较低但反应产物不稳定,酶活数值偏低,且反应时间较长[19]。测量木质素锰过氧化物酶(MnP)酶活常采用愈创木酚法,MnP和Mn2+共同作用于愈创木酚可使其变为棕红色,根据其吸光度不同测定其酶活;木质素过氧化物酶(LiP)酶活的测定常采用藜芦醇氧化速率法,以藜芦醇为底物,H2O2进行催化,测得310 nm下的吸光度值判断LiP的酶活。郭艳艳等[29]利用ABTS、愈创木酚和藜芦醇分别测定不同营养条件下斑玉蕈胞外漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶活性。张仕琦等[30]采用ABTS法和Mn2+混合溶液,通过分光光度计法测定阿魏侧耳NB-1菌株液体发酵产生的胞外漆酶和锰过氧化物酶活性,以优化产木质素降解酶的培养基。

2.2.4 淀粉酶活性 分光光度计法是淀粉酶活性定量分析最常用的方法,可分为碘-淀粉比色法和DNS法。碘-淀粉比色法原理为α-淀粉酶催化水解淀粉,碘液与反应后未被水解的底物淀粉结合成蓝色复合物[31]。淀粉酶DNS法与纤维素酶DNS法原理相同,具有试剂易得和测定准确率高等优点。杨光等[32]采用碘-淀粉比色法测定微量直链淀粉含量,其具有准确、简便和快速等特点。范博文等[31]利用DNS法测定不同碳、氮源对猴头菌胞外淀粉酶活性,并将生长指标与淀粉酶活性聚类分析发现,淀粉酶活性与液体培养菌丝干质量呈正相关关系。

3 食用菌胞外酶的应用

目前,微生物来源的纤维素酶和半纤维酶已经在食品加工、乙醇发酵生产、饲料加工和环境治理等多个领域广泛应用,而食用菌来源的纤维素酶和半纤维酶的应用研究较少且不够深入,主要用于菌种活力的鉴定、栽培基质的筛选和农业生产废物的转化再利用等。杨勇[33]研究发现,食用菌胞外酶中的纤维素酶可作为降解刺梨果渣的主要催化剂,以提高刺梨果渣的利用率并解决刺梨果渣带来的环境问题;徐瑞蔓等[34]报道,食用菌菌糠中含有大量微生物和纤维素半纤维酶,可加快牛粪堆肥的腐熟进程。食用菌木质素降解酶除在菌种培养和栽培中具有重要作用外,在食品安全、工业染料处理和抗肿瘤药物等方面也有研究报道。娄海伟等[35]筛选出食用菌漆酶用以降解黄曲霉毒素B1(AFB1),每年可减少大量谷物因被黄曲霉毒素B1污染而造成的损失;杨建明等[36]从毛木耳粗酶液中分离纯化得到Lac A、Lac B和Lac C 3种漆酶,其中Lac B对RB亮蓝得脱色率达77.4%。马茜茜等[37]从云芝发酵液中纯化得到1种漆酶,其对乳腺癌MCF7细胞和肝癌HePG2细胞均有抑制作用。淀粉酶在以淀粉为原材料的工业中发挥着重要作用,包括淀粉深加工行业、洗涤剂业、纺织业、烘焙食品以及生物燃料等[38]。目前,商品化淀粉酶主要通过微生物发酵法制备,鲜见食用菌淀粉酶制备及应用的研究报道。

4 展望

食用菌胞外酶种类丰富,在食用菌的营养吸收和生长发育过程中具有重要作用。因此,对食用菌胞外酶的作用机理、生物学性质和实际应用等进行研究具有重要现实意义。目前,有关食用菌胞外酶的研究多处于实验室研究阶段,仅有漆酶等少数胞外酶的研究较为深入。我国食用菌资源丰富,其蕴藏的胞外酶及其酶基因具有重要的开发前景。今后可利用高通量筛选技术获得胞外酶活性较高的食用菌菌株,开展对其产酶条件、酶学性质和编码基因等方面的研究。一方面,通过发酵技术制备食用菌胞外酶;另一方面,可克隆其胞外酶基因,利用酶分子的定向进化技术和基因工程手段对其进行改造与生产,使其更适合应用于工业化生产。