响应面模型优化番石榴多糖提取工艺

金萍，杨洪霄，任雪娇

锦州医科大学食品与健康学院（锦州 121000）

番石榴又叫拿果、嗽叭果、芭乐、拔子、鸡矢果等[1]，具有极佳的风味，口感清爽，是一种生长在热带地区的水果[2]。番石榴营养丰富，可补充多种维生素及钾、叶酸、多糖、有机酸等微量元素，还可改善胰岛的功效，因此番石榴具有抗菌、健脑的及提高免疫力的功效及其他多种保健功能[3]。

多糖具有免疫调节、抗病毒抗癌及降血糖等多种功效[4]。国内外越来越多的研究结果也表明多糖在抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、降血糖、抗病毒等方面具有十分良好的活性作用[5-8]。因此如何能够提高番石榴多糖提取率成为研究课题之一。番石榴多糖提取常用的方法有水溶剂提取法、酶解法、微波辅助提取法、超声辅助提取[9-10]。试验探究水溶剂提取番石榴多糖后使用乙醇沉淀法的工艺最优条件。

试验对提取时间、提取温度、提取次数、料液比4个因素进行单因素试验，将所得数据进行响应面优化，确定最佳提取番石榴多糖的工艺，为大规模提取番石榴多糖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

番石榴（市售）。

1.2 试剂

三氯乙酸、活性炭、正丁醇、98%硫酸、苯酚、葡萄糖（AR级，广州化学试剂厂）。

1.3 仪器与设备

UV-2700紫外可见分光光度计、3-HPA粉碎机（上海棱光技术有限公司）；EPPENDORFCENTRIFUGE5415D离心机、SHZ-D-3循环水式真空泵、SKFG-01电热恒温干燥箱（巩义市宇翔仪器有限公司）；RE52CS旋转蒸发仪（浙江力辰仪器科技有限公司）；电动搅拌器（上海坤天试验室仪器有限公司）；SHA-B恒温水浴振荡器、YP-B电子天平（浙江力辰仪器科技有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制

准确移取质量浓度分别为0.00，10.00，20.00，40.00，50.00，60.00和70.00 μg/mL葡萄糖标准溶液各0.2 mL至洁净试管中，继续依次加入1.00 mL 5%苯酚溶液、5.00 mL浓硫酸，振荡均匀，在室温静置6 min，用水浴锅沸水继续反应15 min。反应结束后取出，将溶液冷却至室温，在490 nm处测定其体系吸光度。以吸光度A对葡萄糖浓度c（μg/mL）进行线性回归，得回归方程A=3.62×10-3c-6.43×10-4，R2=0.996 5。

1.4.2 番石榴多糖的提取工艺流程

质地良好的番石榴→挖出果肉→烘干→磨成粉末→采用水溶剂提取法提取→利用活性炭进行脱色→Sevage法脱蛋白→过滤→测定吸光度。

1.4.3 番石榴多糖提取率的测定

用葡萄糖做标准曲线，测定多糖提取率时将吸光度带入方程中，按照式（1）计算多糖提取率。

式中：c为提取液多糖浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；m为番石榴粉末质量，mg。

1.4.4 单因素试验

1.4.4.1 不同提取温度对番石榴多糖提取率的影响

精确称取1.0 g番石榴粉末，固定液料比35∶1（mL/g）、提取时间40 min、提取次数3次，研究不同温度（35，45，55，65和75 ℃）对多糖提取率的影响效果。

1.4.4.2 不同液料比对番石榴多糖提取率的影响

精确称取番石榴粉末，固定提取温度55 ℃、提取时间40 min、提取次数3次，研究不同液料比（10∶1，15∶1，20∶1，25∶1和30∶1 mL/g）对多糖提取率影响。

1.4.4.3 不同提取时间对番石榴多糖提取率的影响

称取1.0 g番石榴粉末，固定提取温度55 ℃、液料比25∶1（mL/g）、提取次数3次，研究不同提取时间（25，30，35，40和45 min）对多糖提取率的影响。

1.4.4.4 不同提取次数对番石榴多糖提取率的影响

精确称取1.0 g番石榴粉末，固定提取温度55 ℃、液料比35∶1（mL/g）、提取时间40 min，研究不同提取次数（1，2，3，4和5次）对多糖提取率的影响。

1.4.5 响应面设计

响应面试验设计如表1所示。

表1 响应面设计因素水平表

1.4.6 试验指标

试验以粗多糖提取率为指标。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 提取温度对粗多糖提取率的影响

图1表明，在35～55 ℃范围内，番石榴中多糖提取率与温度的高低呈正比，提取温度55 ℃时，多糖提取率6.24%达到峰值。55～75 ℃时，多糖提取率呈现下降趋势。这是由于温度的升高，多糖分子会遭到破坏使其丧失活性从而降低提取率。因此，最适提取温度为55 ℃。

图1 提取温度变化对番石榴多糖提取率的影响

2.1.2 液料比变化对番石榴多糖提取率的影响

图2表明，整体来看，番石榴的多糖提取率与液料比呈线性关系，液料比35∶1（mL/g）时，番石榴中多糖提取率为6.44%，达到峰值。随着液料比增大，多糖提取率趋于不变或有下降趋势。这是由于随着体积的增大，多糖分子会向体系外扩散，从而使提取率上升。体积继续增大会有各种杂质增多，从而使提取率下降。所以，最适液料比为35∶1 （mL/g）。

图2 液料比变化对番石榴多糖提取率的影响

2.1.3 提取时间变化对番石榴多糖提取率的影响

图3表明，提取时间20～40 min时，多糖提取率随着时间的增加而增大。提取时间40 min时，番石榴多糖提取率为6.235%，达到峰值，随着时间推移，多糖提取率反而降低，这是因为提取时间增加，使杂质进入，因此使提取率降低。所以，最适提取时间设定为40 min。

图3 提取时间变化对番石榴多糖提取率的影响

2.1.4 提取次数变化对番石榴多糖提取率的影响

图4表明，提取次数为2次时，多糖提取率为6.287 5%，达到峰值。提取次数大于2次时多糖提取率呈现下降趋势。然而提取次数变多，溶剂量也随之变多，可能导致溶出的多糖中带有杂质，并且加大浓缩工作难度。综合上述情况，番石榴多糖最适提取次数为2次。

图4 提取次数变化对番石榴多糖提取率的影响

2.2 响应面结果与分析

响应面结果与分析如表2所示。

表2 响应面的结果与分析

以温度、时间、提取次数、料液比为自变量，以提取率为响应值。对各因素数据进行回归拟合，建立番石榴多糖提取与提取率的二次多项式方程：Y=6.75+0.16A+0.25B-0.18C+0.32D-0.26AB+0.20AC+0.18AD-1.13BC-0.13BD+0.65CD-0.57A2-0.67B2-0.85C2-0.84D2。由表3可看出：所建立模型的P＜0.01，极显著；失拟项P＞0.05，不显著，可看出模型可靠。经过方差分析，根据F值可看出4个因素对胆固醇降低率影响的主次顺序为液料比＞提取时间＞提取次数＞提取温度。

表3 响应面方差分析

根据图5响应面图和3D图可进行分析交互作用及变化趋势。由图5（a）可知，随着提取次数和液料比的升高，番石榴多糖提取率为先增加后降低趋势，并且响应面呈现凸型，等高线为椭圆形，说明提取次数和料液比交互作用较强且有最大值。由图5（b）可知，随着提取时间和液料比增加，多糖提取率出现先增加后降低的变化趋势，响应面呈凸形，等高线为椭圆形，表明提取时间和料液比交互作用有最大值。由图5（c）可知，随着提取时间和提取次数的增加，多糖提取率出现先增加后降低的变化趋势，响应面呈现凸型，并且等高线为椭圆形，说明提取时间和提取次数交互作用较强且有最大值。由图5（d）可以看出，随着温度与料液比的增加，多糖提取率呈现先增加后降低的变化趋势，响应面呈凸型并且等高线为椭圆形，说明温度和料液比交互作用较强且有最大值。由图5（e）可看出，随着温度和提取次数的增加，多糖提取率呈现先增加后降低的变化趋势，响应面呈现凸型，并且等高线为偏椭圆形。由图5（f）可以看出，随着温度和提取时间的增加，多糖提取率呈现先增加后降低的变化趋势，且响应面呈现凸型。

图5 响应面图与3D图

2.3 最佳提取条件的确定

通过Design Expert 8.0软件求解所得回归方程，得出最佳提取的工艺参数：提取温度56.26 ℃、提取时间40.73 min、提取次数1.97、液料比36.84∶1（mL/g），预测的提取率为6.812 92%。考虑到在试验过程的可操作性，将番石榴多糖提取最优工艺调整为提取温度55 ℃、提取时间40 min、提取次数2次、料液比35∶1（mL/g），按照最佳工艺条件进行试验，用以验证模型的准确度，共设置5次平行试验，番石榴多糖的提取率都为6.82%，证明试验结果准确度较高，与预测值基本相符，表明方法可行。

3 结论

采用响应面试验法和单因素试验法，研究从番石榴中分离出的粗多糖的最佳工艺参数。提出的优化生产工艺参数为提取温度55 ℃、液料比35∶1（mL/g）、提取时间40 min、提取次数2次，此时粗多糖提取率最高，为6.82%，含量测定则通过苯酚-硫酸法。水溶剂提取法可较为有效地提取出番石榴多糖。