超声波提取黄秋葵成分工艺优化及提升酿香风味应用

李勇，李韶阳，卢婷，乔丹娜，陈洁，张伟*

1. 云南中烟工业有限责任公司技术中心（昆明 650231）；2. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室（无锡 214122）

众所周知，消费者选择食品的趋势集中在富含对人类健康有积极影响的生物活性化合物的原料上[1]。植物生物活性化合物受到极大关注，其提取工艺包括浸渍、蒸馏和索氏提取在内的常规提取方法具有诸如提取率低、提取溶剂量大、能耗高和过程时间长的缺点[2-4]。绿色提取指在提高提取率的同时，减少提取溶剂、降低能耗、缩短工艺时间的一种提取方法，已经发展以应对生态、环境和经济影响的工业挑战。

超声波作为绿色提取方法之一，被定义为高于20 kHz的频率，这是人类听觉检测的阈值，通常在20～10 000 kHz之间。超声波源通常来自振动探针，该振动探针引起周围溶液的振动，从而启动能量向邻近分子的转移[5-6]。据报道，超声波的剪切力有助于通过空化作用对基质的细胞壁或细胞膜产生破坏作用，从而释放生物活性化合物[7]。

黄秋葵[Abelmoschus esculentus（L.）Moench]，属一年生草本植物，具有相对较高的抗氧化损伤活性和抗菌活性[8-9]，它们被认为是具有抗微生物活性的生物活性化合物颇有前途的来源，并可应用于制药和食品工业。

此次研究通过DPPH和FRAP试验测定黄秋葵提取物的抗氧化性能，以及对总酚化合物、总黄酮含量的测定，以研究不同UAE参数对提取黄秋葵生物活性成分功效的影响[1,5]。此外，还研究了优化黄秋葵提取物（AEME）对卷烟酿香风味提升的作用效果。

1 试验材料与方法

1.1 试验仪器与设备

PLG2000-10传导盘式干燥机（常州市豪迈干燥设备有限公司）；UP400S超声处理器（德国Hielsher公司）；Thermo Scientific GENESYS 10S紫外可见分光光度计（美国赛默飞公司）；Rotavapor R-210旋转蒸发仪（上海Buchi公司）。

1.2 样品制备

在湖南洞庭湖区采摘黄秋葵，在80 ℃热烫1 min之前用干净的流水漂洗。将热烫过的种子通过盘式干燥机在45 ℃下干燥48 h，然后通过实验室研磨机研磨，使用0.250 mm筛孔过筛获得种子粉末。黄秋葵粉末保存在4 ℃的铝箔层压袋中，直到被分析。

1.3 超声波辅助提取

使用超声处理器进行UAE试验，该超声处理器具有可调0～800 W功率、0.7 s周期、24 kHz和钛探头（H22D，22 mm）的优点。在每个试验运行中，将40 g黄秋葵粉末与200 mL乙醇溶剂（70%V/V）混合。提取后，样品用冰浴冷却5 min，然后以565g离心15 min。上清液通过滤纸过滤，并通过旋转蒸发器在40℃除去溶剂。获得精制的黄秋葵提取物并置于4 ℃的琥珀色玻璃瓶中用于进一步的试验。分析精制的黄秋葵提取物的抗氧化性能（通过DPPH和FRAP测定的总酚类化合物、总黄酮含量抗氧化活性）。

1.4 试验设计和模型验证

提取温度、提取时间、提取振幅及提取功率对黄秋葵提取物的抗氧化性能有显著影响。因此，采用Box-Behnken设计（BBD）的响应面法（RSM）获得最佳条件并确定提取变量之间的相关性。提取参数的编码值和BBD的试验运行分别在表1和表2中详述。按照最优条件进行试验，将试验数据与模型预测值进行比较。根据RSM中的两位小数，进行舍入以获得实际数字（值＜0.50时向下舍入，值≥0.50时向上舍入）。为了确定模型的有效，采用最小二乘法拟合二次多项方程表达响应值，按式（1）计算。

表1 工艺中心试验分析试验因素与水平

表2 工艺中心试验分析试验结果

接表2

式中：Y为响应值（总酚类化合物或总黄酮含量或抗氧化活性）；A、A0、Aii、Aij为方程系数；Xi、Xj（i≠j）为自变量编码值。采用统计学的F值、P值及方差分析检验模型方程多项式各系数的拟合和回归性，结果如表3所示。

表3 回归模型分析

1.5 总酚类化合物的测定

总酚类化合物采用Folin-Ciocalteu法测定，并稍作修改[10]。将20 mL样品与1.58 mL蒸馏水混合。然后向混合物中加入100 mL Folin Ciocalteu试剂。孵育5 min后，向混合物中加入300 mL碳酸钠，并在室温下静置2 h。使用分光光度计在765 nm波长处测量混合物的吸光度。总酚类化合物表示为mg没食子酸当量（GAE）/100 g干重。

1.6 总黄酮含量的测定

根据前人研究报告的方法，通过氯化铝比色法分析总黄酮含量[6]。将0.5 mL样品与2 mL蒸馏水、0.15 mL 5%亚硝酸钠和0.15 mL 10%氯化铝混合。在环境温度下温育5 min后，向混合物中加入2.2 mL蒸馏水，并在波长510 nm处测量吸光度。结果表示为mg槲皮素当量（QE）/100 g干重（mg QE/100 g干重）。

1.7 通过铁还原抗氧化能力（FRAP）测定的抗氧化活性

根据前人研究报告的方法，采用FRAP测定法[6]的抗氧化活性。将50 mL样品与950 mL温热（37 ℃）的FRAP溶液混合。在环境温度下孵育4 min后，在593 nm波长处测量吸光度。反应持续30 min，计算每个样品的最终吸光度和空白吸光度之间的差异。FRAP试验的抗氧化活性表示为mmol/L Trolox。

1.8 DPPH法测定抗氧化活性

根据Brand-Williams等[6]描述的方法进行修改，通过DPPH测定法进行抗氧化活性。将20 mL样品与950 mL DPPH溶液混合，并将混合物置于黑暗和环境温度下15 min。在波长515 nm处测量吸光度，并将甲醇用作参考样品。DPPH溶液的吸光度（A初始）和样品的吸光度（A最终）之间的吸光度变化的差值按式（2）计算。结果基于用不同Trolox溶液（82～5 000 mol/L）制备的标准曲线计算，并表示为mmol/L Trolox。

1.9 酿香风味评价

1.9.1 感官评价

将黄秋葵提取物（AEME）、基于Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母菌制备的酿香香精（SCE）及两者按照质量比为1∶4制备的复合酿香香精（AEME+SCE），按照0.5%的质量比例均匀加入云南中烟空白烟丝中，制成试验样品；经干燥调节水分（烟丝含水率在10%左右），再卷制成卷烟。采用中式卷烟感官评价方法，对AEME、SCE、AEME+SCE在叶组中的感官质量进行评价打分，取感官评价分值的平均值。

1.9.2 挥发性成分总量的测定

参照YC/T 145.9—2012《烟用香精挥发性成分总量通用检测方法》[10]，在沸水浴上分别加热蒸发一定量的3种AEME、SCE、AEME+SCE添加物120 min，蒸发前试样的量和蒸发后残留物量之差与蒸发前试样量之比即为挥发性成分总量。

1.10 统计分析

所有试验重复3次，使用SPSS 20.0版统计软件通过单向方差分析（单向ANOVA）分析数据。使用Duncan多重范围检验分离平均值，并在P≤0.05时考虑显著差异。数据以平均标准偏差（SD）表示。Minitab 16统计软件用于建立回归模型，组成Box-Behnken设计并从UAE试验预测抗氧化性能的最佳条件。

2 试验结果与讨论

2.1 黄秋葵超声波辅助提取工艺的优化

包括乙醇体积分数、振幅、功率、温度和时间在内的几个试验变量对UAE的有效性起着至关重要的作用。在此研究中，将体积分数70%的乙醇设置为固定因素，以确定UAE抗氧化性能的优化条件。因为，根据初步研究显示，该条件通过DPPH和FRAP分析提供了最高的抗氧化性能值，包括总酚类化合物、总类黄酮含量和抗氧化活性。这也与以前的研究相一致，即报道的70%乙醇是获得最高总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性的合适条件。因此，在响应面方法中建立了4个独立变量，即温度、时间、振幅和功率。试验结果如表2所示。

采用Box-Behnken试验设计的响应面方法通过DPPH和FRAP分析确定总酚化合物、总黄酮含量和抗氧化活性的最佳提取条件。DPPH和FRAP分析表明，总酚、总黄酮含量和抗氧化活性的变化范围分别为357.24～518.02 mg GAE/100 g干重，7.97～13.44 mg QE/100 g干重，887.42～1 314.00 mmol/L Trolox和1 023.24～1 561.56 mmol/L Trolox。模型拟合度的方差分析（ANOVA）结果如表3所示。R2均高于0.890 0，结果显示DPPH和FRAP分析结果、总酚、总黄酮含量模型与试验数据拟合良好。试验变量的回归系数值如表4所示。

表4 拟合的二次多项式回归方程系数

为了评价独立变量对抗氧化性能的影响（通过DPPH和FRAP测定的总酚类化合物、总黄酮和抗氧化活性），绘制了模型的交互作用图，用于确定最佳值以获得AEME的最佳抗氧化性能，并用于通过DPPH和FRAP测定观察温度、时间和振幅对总酚类化合物、总黄酮和抗氧化活性的影响，如图1～图4所示。

图1 总酚类化合物（Y1）影响因子交互作用图

提取参数对总酚类化合物的影响如图1所示。温度升高对总酚类化合物的产量有积极影响，这一结果与之前关于酚类化合物提取优化的研究一致。此外，这一结果也与以前的研究很好地一致，以前的研究报道通过使用乙醇溶剂加热提取溶剂观察到酚类化合物的产量增加[3]。振幅项是总酚类化合物模型方程中最有意义的项，而温度的二次项（X12）具有最大的负面影响。总酚类化合物的提取变量与二次回归模型有很好的相关性，如表4所示。

UAE的性能主要取决于介质中的空化现象促进溶剂的压缩和膨胀，并激活溶剂的微射流形成。这启动了基质细胞中微孔的形成，加速了溶剂向位于细胞内成分中的目标化合物的通过。

通过DPPH和FRAP分析，振幅的增加促进了总酚类化合物的产量（如图1所示）、总黄酮含量（如图2所示）和抗氧化活性（如图3和图4所示）。然而，高于特定水平的振幅会降低提取效率，因为会引发小气泡的形成，从而降低通过溶剂的超声波能量传输。时间也是一个重要因素，对黄秋葵中酚类化合物和黄酮类化合物的提取有直接影响[5]。因此，提取时间越长，提取化合物的产量越大。然而，过长的提取时间会对提取的化合物产生负面影响，导致其降解。

图2 总黄酮含量（Y2）影响因子交互作用图

图3 FRAP（Y3）影响因子交互作用图

图4 DPPH（Y4）影响因子交互作用图

总黄酮含量的提取率与变量之间的关系如表4所示。超声波辅助提取对总酚和总黄酮的提取有显著影响。当提取温度升高到一定值时，提取量增加。这种结果可能是温度的升高导致更大的传质，从而导致更高的提取率，但是过高的温度可能会对生物活性化合物造成损害[11,13-15]。此外，一些研究表明，总酚类化合物和总黄酮含量往往随着植物材料UAE的增加而增加。然而，过度暴露于超声波可随后导致生物活性化合物的降解，因此，UAE中合适的振幅对于在质量和数量方面实现高水平的生物活性化合物至关重要。

抗氧化活性测定的不同方法已得到充分证明，最常选择的方法是DPPH测定法（清除DPPH自由基的活性或提供H原子的能力）和FRAP测定法（还原金属离子的活性或提供H原子的能力）[11]。在此次研究中，通过DPPH和FRAP分析评估了UAE变量对AEME抗氧化活性的影响[13]。总的来说，AEME抗氧化活性的差异显著（P≤0.05）依赖于UAE条件。

温度和振幅的二次效应（X1X3）对超声波辅助提取下DPPH法测定的抗氧化活性没有显著影响。其余因素对DPPH法抗氧化活性的影响显著（P≤0.05）。此外，通过DPPH分析，温度和振幅线性项有助于对抗氧化活性的积极影响。

回归模型分析结果（表3）显示，通过FRAP测定，多项式模型对抗氧化活性非常显著（P≤0.05），其主要受振幅影响。通过FRAP分析，时间和振幅的二次效应以及时间和振幅之间的相互作用揭示了对抗氧化活性的显著影响。通过FRAP测定抗氧化活性，拟合的二次多项式回归方程系数如表4所示。

通过DPPH和FRAP分析，超声波辅助提取对抗氧化活性的主要影响是增加细胞壁的渗透性，导致酚类化合物和黄酮类化合物的更大提取量。

酚类化合物的化学结构和官能团数目，包括：（1）芳环上醇基的数目和位置；（2）分子大小；（3）柔韧性/笨重性；（4）水溶性在很大程度上涉及抗氧化活性。此外，芳香羟基化环提供氢原子的能力说明了酚酸的抗氧化活性。抗氧化活性和总酚类化合物之间的关系已经被很好地证明，并且据报道次级代谢物尤其是酚类化合物是负责抗氧化活性的关键活性化合物[1]。

2.2 最优UAE条件及其验证

在运行若干数值优化后，预测的优化条件是温度53.08 ℃，时间36.44 min，振幅43.04%和功率502.91 W。为方便实际操作，四舍五入后，参数修正为温度53 ℃，时间36 min，振幅44%，功率500 W。为验证模型的有效性，试验从最佳提取条件获得的所有响应（总酚含量、总黄酮含量和抗氧化活性）的预测值和试验值如表5所示。根据验证结果，试验响应和最佳条件的预测值之间的微小变化或差异证实了所提出的最佳UAE条件的有效性。因此，通过对总酚化合物及总黄酮含量的测定、DPPH和FRAP分析总酚、总黄酮含量和抗氧化活性，证明预测模型可用于优化黄秋葵对总酚化合物及总黄酮等生物活性成分的提取条件。

表5 试验值与预测值比较结果

2.3 酿香香精效果评价结果与分析

通过分别将上述添加物AEME、SCE、AEME+SCE添加至卷烟中，对其在卷烟中的作用进行感官评价，评价结果如表6所示。

表6 不同添加物在卷烟中的感官评价结果

如表6所示，单一添加直接浸润提取的黄秋葵提取物，挥发性成分总量较低，且在卷烟中的作用效果一般，主要原因可能是提取工艺造成原料有效挥发性致香成分的变化和损失。AEME及SCE在卷烟叶组中的表现都较好，能增加清甜香韵，提升香气质感，改善口感。复配酿香味香精AEME+SCE的效果明显优于单一加入的组分，其协同增效的优势较为显著，尤其在酿香回味上，这说明超声辅助的绿色提取工艺及复配香精的技术手段都能够充分发挥原料的生物活性物质的优势，从而大大提高应用效果。

3 结论

在此研究中，BBD结合响应面法被成功地用于确定黄秋葵抗氧化性能（总酚化合物、总黄酮含量和抗氧化活性）的UAE的最佳试验参数。对温度、时间、振幅和功率四个提取参数进行优化，以获得最高的抗氧化性能。四个参数的最佳条件为温度53 ℃、时间36 min、振幅44%、功率500 W。结果表明，黄秋葵提取物抗氧化性能的预测值与试验值之间没有显著差异。复配酿香味香精AEME+SCE的效果明显优于单一加入的组分，在酿香回味上的协同增效的优势较为显著。这说明超声辅助的绿色提取工艺及复配香精的技术手段能够充分发挥原料的生物活性物质的优势，从而大大提高应用效果。