谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对酒精性肝损伤的保护作用

孙锦，张小丽，王莹莹，唐铜，程倩，陈智仙

1. 酵母功能湖北省重点实验室（宜昌 443000）；2. 宜昌市营养健康食品工程技术研究中心（宜昌 443000）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸缩合而成的三肽化合物，大量存在于酵母、小麦胚芽、动物和人体肝脏、肾脏及红细胞中[1]。GSH主要以还原型形态存在于真核细胞，约90%分布于胞浆，还有少量分布在线粒体、内质网及细胞核[2]，其极易被氧化为氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），因此对维持细胞内正常的氧化还原环境具有重要作用[3]。药理学研究证实谷胱甘肽具有抗氧化[4]、解毒[5]、调控免疫[6]等作用，临床上用于治疗或辅助治疗肝脏疾病[7]、胰腺疾病[8]、肾脏疾病[9]、帕金森病[10]、急性心肌梗死[11]等。硒是生物体所必需的微量营养元素之一，其作为谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）的活性中心，在清除体内活性氧自由基方面有重要作用[12]。酵母具有较高的富硒能力，能将无机硒转化为有机硒，降低无机硒的毒性、提高生物利用度。另外，除了补充硒元素外，富硒酵母还能同时提供丰富的B族维生素、优质蛋白质、氨基酸等营养物质[13]。已有研究表明富硒酵母具有预防肿瘤[14]、降血糖[15]、降血脂[16]、降血压[17]、增强人体免疫力[18]等诸多功效。

我国酒文化源远流长，无酒不成席的饮食习俗也导致酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是我国常见的肝脏疾病之一，并且发病年龄逐渐年轻化。肝实质细胞是乙醇代谢的主要场所，长期或过量饮酒使得肝实质细胞一直受到乙醇及其代谢产物的刺激，从而诱导线粒体损伤、内质网应激，活性氧（reactive oxygen species，ROS）蓄积、脂肪堆积等，最终导致肝细胞损伤[19]。已有研究证实谷胱甘肽能明显改善酒精性肝损伤，促进酒精性肝病的恢复[20]。此外，有研究指出富硒酵母对化学性肝损伤具有保护作用[21]。然而，谷胱甘肽和富硒酵母联合对酒精性肝损伤的保护作用尚鲜见报道。因此，试验将谷胱甘肽与富硒酵母混合制得谷胱甘肽富硒酵母复合制剂，通过小鼠试验研究其对酒精性肝损伤的保护作用，为保健食品的开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品

谷胱甘肽富硒酵母复合制剂（安琪酵母股份有限公司），成人体重按60 kg计算，折合人体推荐量为0.016 7 g/（kg·Bw）。

1.2 仪器及试剂

T6新世纪紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；BS-420全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；RM2235切片机（德国Leica公司）；YABO-400组织包埋机（常州雅博电子设备有限公司）；HD-330摊片烤片机（湖北慧达仪器有限公司）。

丙二醛（MDA）测定试剂盒、还原型GSH测定试剂盒、甘油三酯（TG）测定试剂盒、无水乙醇（分析纯）、甲醛等。

1.3 试验动物

由西安交通大学医学院实验动物中心提供的S P F 级昆明种雄性小鼠5 0 只（质量合格证号61001700003135），体重18～22 g，生产许可证号SCXK（陕）2018-001。试验动物房为屏障系统，使用许可证号SYXK（陕）2018-009，温度20～25 ℃，相对湿度45%～65%。动物饲料、垫料均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.4 试验方法

1.4.1 样品制备

分别称取0.50，0.33和0.17 g样品，依次加蒸馏水至20 mL，混合混匀，分别配成浓度为2.50%，1.65%和0.85%的混悬液，备用。

1.4.2 动物分组及处理

随机将雄性小鼠分为5组，每组10只，分别为阴性对照组、模型对照组及高、中、低3个剂量组。3个剂量组分别给予0.50，0.33和0.17 g/（kg·Bw）的样品（相当于人体每日推荐量的30，20和10倍），阴性对照组和模型对照组给予同等体积的蒸馏水，按20 mL/（kg·Bw）每天经口灌胃1次。每周称2次体重，以此调整受试样品灌胃体积。在试验第30天时将模型对照组和3个剂量组，一次经口灌胃50%乙醇溶液，剂量为12 mL/（kg·Bw），阴性对照组给予同体积的蒸馏水，禁食不禁水16 h后称终体重，颈椎脱臼处死。

1.4.3 小鼠肝脏组织生化指标的检测

取0.50 g处死后小鼠的肝脏，按1∶9 g/mL加入生理盐水，匀浆后按3 000 r/min离心10 min，取上清液，制得10%肝匀浆，然后按照试剂盒要求进行各项指标（MDA、还原型GSH、TG）的检测。

1.4.4 小鼠肝脏组织病理学诊断

将各组动物肝脏从肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，苏丹Ⅲ染色。在光学显微镜下采用40倍物镜从肝脏的一端视野开始连续观察整个染色组织切片，主要观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积，分别记录每个视野中的各种病变所占视野的面积，累计所有视野观察情况，根据评分标准分别对样品的肝脏脂质蓄积情况进行评分，以此评估肝细胞损伤程度。详细评分标准如表1所示。

1.4.5 试验数据统计

采用Minitab软件对数据进行统计分析，试验数据以平均值±标准偏差（SD）表示。采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）测定统计学显著性，P＜0.05被认定为组间具有统计学意义上的显著差异。

1.5 评定标准

在酒精性肝损伤模型成立的前提下，肝脏MDA、还原型GSH和TG这3项检测指标结果阳性，或者肝脏MDA、还原型GSH和TG这3项指标中任2项指标阳性和病理组织学检查结果阳性，满足以上任一条件，可判定受试样品具有对酒精性肝损伤有辅助保护作用。

2 结果与分析

2.1 谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对小鼠体重的影响

试验期间，各组小鼠生长发育良好，饮食饮水正常。通过对各组小鼠体重的检测发现（表2），谷胱甘肽富硒酵母复合制剂各剂量组与阴性对照组比较，小鼠的体重增长无显著变化（P＞0.05），表明谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对小鼠体重无影响，可初步判断谷胱甘肽富硒酵母复合制剂具有一定安全性。另外，模型对照组小鼠与阴性对照组比较，体重增长也无显著变化（P＞0.05），排除体重对结果的影响。

表2 谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对各组试验小鼠体重的影响

2.2 谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对小鼠肝匀浆中MDA、还原型GSH、TG含量的影响

在试验第30天按照12 mL/（kg·Bw）的剂量给予模型对照组和阴性对照组小鼠50%乙醇，以此建立急性酒精性肝损伤模型。由图1所示，与阴性对照组比较，模型对照组小鼠肝组织中MDA值升高，还原型GSH值降低，TG值升高，差异均有极显著性（P＜0.01），说明试验模型成立。由图1（a）所示，与模型对照组比较，各剂量组小鼠肝组织中MDA值均无明显降低，差异均无显著性（P＞0.05）。由图1（b）所示，相比于模型对照组，高剂量小鼠组肝组织中还原型GSH值升高，差异有极显著性（P＜0.01）。由图1（c）所示，相比于模型对照组，高剂量组小鼠肝组织中TG值降低，差异有显著性（P＜0.05）。由此判定还原型GSH和TG值2项指标结果均为阳性。

图1 谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对肝组织中MDA（a）、还原型GSH（b）、TG（c）含量的影响

2.3 谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对小鼠肝脏病理组织学的影响

观察各组小鼠肝组织病理切片，以肝脏脂质蓄积情况进行评分。由表3可见，模型对照组与阴性对照组比较，肝脏脂肪细胞变性评分在统计学上有显著性差异（P＜0.01），说明小鼠酒精性肝损伤模型造模成功。与模型组比较，各剂量组肝细胞脂肪变性程度均减轻，高、中剂量组与模型对照组比较均有显著性差异（P＜0.01，P＜0.05）。病理组织学指标可判断为阳性。

表3 谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对小鼠肝脏组织病理学的影响

3 结论

肝实质细胞是乙醇代谢的主要场所，乙醇被细胞质中的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化成醛类，进入线粒体，在乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）的作用下还原为乙酸，从而排出体外起到解毒作用[22]。在乙醇代谢的过程中，会产生大量ROS。长期和/或大量饮酒使得ROS蓄积，造成氧化应激，导致蛋白质损伤、DNA损伤、脂肪变性、炎症反应等，最终造成严重的肝损伤[23]。过量的ROS与生物膜不饱和脂肪酸作用，产生脂质过氧化物，引起MAD含量升高，因此MAD含量能间接反映肝细胞膜的受损程度[24]。另外，ROS的增加量也远高于还原型GSH等抗氧化剂的量，将消耗体内的还原型GSH，使还原型GSH含量降低[25]。同时乙醇的摄入通过下调腺苷酸活化蛋白激酶或内质网应激反应间接刺激固醇调节元件结合蛋白的表达，增强多种脂肪酶的合成，从而促进TG的合成并在肝脏中沉积，使其含量不断升高[26-27]。

试验中，通过测定比较不同组别小鼠肝组织中的MDA、还原型GSH、TG的含量，评估酒精肝损伤模型的建立效果，以及受试样品对肝脏的保护作用。将模型对照组与阴性对照组比较，其MDA值升高，还原型GSH值降低，TG值升高，且具有极显著性差异，说明试验中酒精性肝损伤的模型建立成功，试验方法可靠。与模型对照组比较，受试样品高剂量组的还原型GSH值显著升高，TG值显著降低，说明该受试样品具有降低酒精性肝损伤小鼠肝脏TG含量，并升高还原型GSH含量的作用。同时，通过观察肝脏组织病理变化，结果发现与阴性对照组比较，模型对照组的肝组织病变严重，肝脏脂肪细胞变性评分显著升高，进一步验证酒精肝损伤模型建立成功。而与模型对照组比较，受试样品各剂量组肝细胞脂肪变性程度均减轻，且高、中剂量组有显著性差异，说明该受试样品能保护小鼠肝脏细胞，减轻脂肪变性。试验结果证实，谷胱甘肽富硒酵母复合制剂对酒精性肝损伤具有辅助保护作用。