水稻冷胁迫响应蛋白OsCML16的外源表达、纯化及质谱验证

卿冬进,邓国富,戴高兴,潘英华,陆春菊,李经成,周维永,陈韦韦,梁海福,陈荣林

(1.广西农业科学院水稻研究所/广西水稻遗传育种重点实验室,南宁 530007;2.广西农业科学院,南宁 530007)

【研究意义】水稻是重要的粮食作物之一,哺育世界约50%的人口[1]。低温胁迫可导致冷敏感水稻在苗期受到严重伤害,生长速率减缓,后期则导致花粉不育[2-3]。广西农业科学院水稻研究所杂交水稻遗传育种课题组基于iTRAQ标记的定量蛋白组学方法在耐冷水稻品种空育131中筛选到1个冷胁迫过程中正调控蛋白OsCML16(蛋白编号Q5ZCK5)[4],该蛋白是细胞内Ca2+信号传递相关的调控蛋白家族Calmodulin-like(CML)成员之一,但外源表达OsCML16蛋白及其生物学功能研究还尚未见报道。因此,利用大肠杆菌表达水稻冷胁迫响应蛋白OsCML16,并纯化该蛋白用于后续的OsCML16蛋白抗体制备,可为研究OsCML16蛋白的耐冷分子功能打下基础。【前人研究进展】目前,越来越多的分子生物学研究阐述了水稻基因及蛋白在低温胁迫下的响应。细胞膜上温度感应器COLD1/RGA1复合体先接收到低温信号,然后激发钙离子进入细胞、产生活性氧、积累脱落酸和OsMKK6-OsMPK3级联反应,导致下游位于细胞核内的转录因子响应[5-7]。Luo等[8]研究发现,COLD1下游的维生素E—维生素K1亚网络是低温耐受性提高的核心调控位点。已有研究发现一些水稻冷耐受相关调控基因,如CTB4a基因与ATP合酶AptB的一个β亚基相互作用调控水稻细胞ATP供应,增强水稻冷耐受性[9];粳稻栽培品种的bZIP73Jap蛋白与bZIP71蛋白相互作用调节脱落酸水平和活性氧水平能增强水稻对冷气候的耐受性[10];水稻OsMADS57蛋白与OsTB1蛋白相互作用,并通过直接调控OsWRKY94激活其转录而启动低温防御反应[11]。Zhao等[12]利用数量性状(QTL)定位与全基因组表达分析法在杂交水稻苗期的不同冷环境条件下鉴定出冷耐受相关基因qCTS-9。Sun等[13]利用QTL定位与混合分组分析法(BSA)在耐冷粳稻品种空育131中鉴定出1个与抗冷相关的功能基因qPSST6。CML(Calmodulin-like) 蛋白能在植物受到刺激后调控细胞内Ca2+信号传递,具有重要信号传感器的作用[14]。蛋白组学技术已在水稻低温胁迫过程挖掘其调控蛋白的研究方面得到广泛应用,如早期的蛋白组学采用双向凝胶电泳(2-DE)方法分离水稻冷胁迫响应蛋白并进行质谱分析[15-17];用iTRAQ标记与质谱相结合的定量蛋白组学方法分析冷胁迫处理水稻材料,发现调控蛋白与光合、代谢、ATP合成、活性氧、DNA结合及转录、胁迫响应等相关[18-20]。大肠杆菌表达水稻蛋白并进一步纯化蛋白可为后续的水稻蛋白功能研究提供参考,杜巧丽等[21]克隆水稻低温诱导基因OsHDAC15并在大肠杆菌中成功表达,可用于基因参与蛋白修饰及其在组蛋白去乙酰化作用方面的研究。【本研究切入点】至今,尚无外源表达OsCML16蛋白及其生物学功能研究的相关报道,因此亟待开展对该蛋白在水稻耐冷上的生物学功能研究并进一步纯化和质谱验证。【拟解决的关键问题】以基因重组方法构建原核表达载体,通过IPTG诱导OsCML16蛋白在外源表达,并进一步采用亲和层析方法得到目的蛋白,为后续制备OsCML16蛋白抗体用于研究该蛋白在水稻耐冷上的功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2022年3—8月在广西农业科学院水稻遗传育种重点实验室进行。耐冷粳稻品种空育131由广西农业科学院水稻研究所保存提供。选取饱满种子在清水中浸泡24 h,用毛巾保湿24 h于37 ℃下催芽,发芽良好的种子播种到土壤中,在25 ℃人工气候箱中16 h光照和8 h黑暗交替培养至三叶期,液氮收集地上部分组织用于RNA提取。大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)及原核表达载体pET30a由香港科技大学生命科学院李凝教授实验室提供。

主要试剂:PCR mix和DL 2000 DNA Marker均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司,植物总RNA提取试剂盒及反转录试剂盒购自南京翼飞雪生物科技有限公司,限制性内切酶XhoI、BamH I、T4-DNA连接和Q5高保真DNA聚合酶均购自美国NEB公司,快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自日本TaKaRa公司,Ni-NTA树脂购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 试验方法

1.2.1 OsCML16蛋白跨膜结构预测 采用生物信息学分析和蛋白跨膜区分析软件(TMHMM 2.0)对OsCML16蛋白跨膜区进行预测,确保原核表达的区域不包含跨膜区蛋白序列。

1.2.2CML16基因克隆 水稻总RNA提取与cDNA合成:将收集的空育131水稻组织在液氮中研磨成粉末,用植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,再以cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA,-20 ℃保存备用。

原核表达载体pET30a-OsCML16构建:根据前期蛋白组学鉴定到的冷胁迫正调控蛋白OsCML16序列,在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中获得对应的cDNA序列,以空育131的cDNA为模板,根据pET30a载体多克隆位点选用BamH I和XhoI为酶切位点,设计双引物扩增带酶切位点的OsCML16基因(OsCML16-F:5′-CGGGATCCATGTCGAACACCACCGAG-3′,OsCML16-R:5′-CCGCTC GAGCTCCGTCTTGGCCTTGT-3′)。PCR反应体系50.0 μL:5× Q5 Reaction Buffer 10.0 μL,10 mmol dNTP Mix 1.0 μL,10 mmol/L正、反向引物(R)各1.0 μL,cDNA模板3.0 μL,Q5高保真DNA聚合酶(2 U/μL) 0.5 μL,ddH2O 33.5 μL。扩增程序:98 ℃预变性2 min;98 ℃ 10 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,进行35个循环;72 ℃延伸2 min。PCR扩增产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测,并对目标片段进行切胶回收。对回收纯化的目标片段和pET30a原核表达载体分别用BamH I和XhoI限制性内切酶在37 ℃水浴进行双酶切3 h。酶切产物在10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳,并切胶回收目的条带。将酶切回收的目的基因片段与载体按照5∶1的物质量比混合,加入T4-DNA连接酶和连接缓冲液,在16 ℃水浴中连接过夜。以连接产物转化DH5α感受态细胞,并全部涂布于含有50.0 μg/mL卡那霉素的LB培养基上,37 ℃培养过夜,从含卡那霉素的LB培养基上挑选单菌落,37 ℃摇菌培养过夜。从大肠杆菌中提取质粒,分别进行PCR鉴定和双酶切鉴定,并取阳性质粒进行DNA测序分析。

1.2.3 OsCML16蛋白可溶性表达及纯化 将50 ng序列正确的重组质粒pET30a-OsCML16置于42 ℃水浴热激45 s后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后涂布到含卡那霉素抗性的LB培养基上,37 ℃过夜培养,挑选2～4个单克隆菌落到3 mL加抗生素的LB液体培养基中,37 ℃下200 r/min振荡过夜培养。取2 mL菌液按照1∶100倒入200 mL加抗生素的LB液体培养基,稀释培养至吸光值OD600为0.6～0.8,加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG,28 ℃诱导表达4 h。4 ℃下7000 r/min离心15 min,收集菌体沉淀放置在冰上,加入40 mL裂解液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑,pH 8.0)悬浮沉淀,用超声波破碎仪破碎细胞,4 ℃下9000 r/min离心15 min,收集上清可溶性蛋白液。取10 μL上清可溶性蛋白液用10% SDS-PAGE胶分离检测目标蛋白的表达情况,剩余上清可溶性蛋白液用于进一步蛋白纯化。

取1 mL的Ni-NTA树脂加入15 mL空柱中,加入5 mL裂解液到层析柱中平衡树脂,将蛋白裂解液加入层析柱中,收集川流液。用5 mL清洗缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑,pH 8.0) 去除非特异结合树脂蛋白,最后用洗脱液(50 mmol/L NaH2PO4、300 mmol/L NaCl、250 mmol/L 咪唑,pH 8.0) 洗脱目标蛋白,并用SDS-PAGE胶洗脱结果。

1.2.4 纯化OsCML16蛋白质谱鉴定 采用切胶方法将SDS-PAGE胶中的目标蛋白收集到1.5 mL管中,参考Li等[22]的胶内胰酶消化方法收集蛋白多肽,然后将蛋白多肽溶入0.1%甲酸,并用蛋白质谱仪器(Triple TOF5600,SCIEX) 进行蛋白定性分析。

2 结果与分析

2.1 OsCML16蛋白跨膜结构预测

为确认包含181个氨基酸的水稻OsCML16蛋白能否在大肠杆菌中表达,首先采用蛋白跨膜区分析软件(TMHMM 2.0)对OsCML16蛋白跨膜结构进行预测分析。预测结果表明,OsCML16蛋白内没有包含跨膜结构区域(图1)。因此,OsCML16蛋白全长序列可用于设计原核表达并有可能获得相应的蛋白。

图1 OsCML16蛋白跨膜结构预测Fig.1 Prediction of transmembrane region of OsCML16 protein

2.2 pET30a-OsCML16原核表达载体设计

根据对OsCML16蛋白跨膜预测结果,将OsCML16蛋白全长对应的基因序列用于构建pET30a-OsCML16原核表达载体。首先,对OsCML16基因CDS序列进行酶切位点分析,与表达载体pET30a的多克隆位点比较,发现OsCML16基因不包含BamH I和XhoI酶切位点,因此这2个酶切位点可用于pET30a-OsCML16原核表达载体构建。BamH I和XhoI酶切位点的外端均可表达6× His标签蛋白,便于后续蛋白纯化。设计的原核表达载体命名为pET30a-OsMCL16,共包含5931个碱基(图2)。

图2 pET30a-OsCML16重组质粒Fig.2 Recombinant plasmid pET30a-OsCML16

2.3 pET30a-OsCML16原核表达质粒构建

首先在耐冷水稻品种空育131中提取总RNA反转录合成cDNA模板,用于克隆OsMCL16基因。提取到的水稻总RNA经凝胶电泳检测其质量,其RNA凝胶电泳图上可见28S 和18S RNA条带清晰(图3-A),表明提取到的RNA质量较好,无明显降解,可用于反转录cDNA。因此,采用反转录试剂盒将RNA反转录并获得对应的cDNA 样品用于OsCML16基因扩增。以cDNA 为模板,OsCML16-F为正向引物,OsCML16-R为反向引物进行高保真PCR扩增OsMCL16基因CDS。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图3-B所示,扩增产物为单一的基因片段条带,大小约300 bp。 PCR扩增产物纯化后,用BamH I和XhoI酶对纯化产物和pET30a载体同时进行双酶切,然后将酶切产物与酶切的pET30a载体用T4-DNA连接酶进行连接并转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞中。挑选单菌落接种到含卡那霉素的LB培养液中培养16 h,提取质粒用于PCR扩增,以BamH I和XhoI双酶切进行验证。从图3-C中可看出,PCR扩增产物的基因片段约300 bp,与用于克隆的PCR产物及酶切产物的基因片段大小一致。最后采用DNA测序方法验证了插入基因的序列完全正确,可用于目的蛋白表达。

M:DL2000 DNA Marker; A:RNA质量检测;B:OsCML16基因扩增,其中,1为PCR产物;C:重组质粒PCR和酶切检测,其中,2为PCR扩增产物,3为pET30a载体阴性对照PCR扩增产物,4为重组质粒的BamH I和Xho I双酶切产物,5为pET30a载体的BamH I和Xho I双酶切产物。M:DL2000 DNA Marker;A: RNA quality test; B: Amplification of the OsCML16 gene, 1 represented PCR product; C: PCR and enzyme digestion validation of the recombinant plasmid, 2 represented PCR product, 3 represented PCR product from the negative control of pET30a vector, 4 represented BamH I and Xho I digestion product of the recombinant plasmid, 5 represented BamH I and Xho I digestion product of the negative control of pET30a vector.图3 OsCML16基因扩增、重组质粒PCR和酶切检测Fig.3 Amplification products of OsCML16,PCR and enzyme digestion validation of the recombinant plasmid

2.4 OsCML16蛋白诱导表达及纯化

以测序正确的原核表达载体pET30a-OsCML16转化到BL21(DE3)感受态细胞中,在携带卡那霉素的LB培养基上选取阳性克隆单菌落,接种到3 mL含卡那霉素的LB液体培养基中,放入37 ℃摇床中振荡培养过夜。吸取2 mL菌液接种到200 mL含卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养,放入37 ℃摇床中振荡培养至吸光值OD600为0.6～0.8。加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,然后放入28 ℃摇床中振荡培养诱导目的蛋白表达,诱导4 h后将菌液分装到50 mL离心管中,4 ℃离心收集菌体,加入40 mL裂解液,用枪头吸打重悬菌体,在冰浴中用超声波破碎细胞5 s,间隔5 s,共破碎30 min;在4 ℃条件下,9000 r/min离心15 min,收集上清可溶性蛋白液和沉淀。取10 μL上清可溶性蛋白液并加入10 μL 2×蛋白上样缓冲液,在100 ℃ 水中煮5 min,用于10%的SDS-PAGE电泳检测。

上清蛋白与Ni-NTA树脂结合,用包含250 mmol/L洗脱缓冲液洗脱His6-OsCML16-His6融合蛋白,安装1.5 mL收集管,按照每管1 mL的量共收集7管洗脱His6-OsCML16-His6融合蛋白。然后取10 μL穿流液和10 μL各管洗脱液用于10%的SDS-PAGE电泳检测。从图4可知,His6-OsCML16-His6融合蛋白可在大肠杆菌中表达,蛋白分子量约为30 kD,且为可溶性蛋白,超声波破碎后存在上清液中,上清液中的蛋白从Ni-NTA树脂洗脱后,获得了纯化的浓缩His6-OsCML16-His6融合蛋白,其中第2～4 mL洗脱液的融合蛋白含量较高。

M:预染蛋白marker;S:超声波破碎的蛋白上清液;F:过柱后流穿液;E1～E7:洗脱液管1～7。M: Prestained protein marker; S: Protein supernatant after sonication; F: Flow through; E1-E7: Elution fraction 1-7.图4 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定His6-OsCML16-His6融合表达蛋白的纯化结果Fig.4 The purification result validation of His6-OsCML16-His6 fusion expressed protein using SDS-PAGE gel electroporesis

2.5 OsCML16蛋白质谱验证

为进一步验证纯化获得的蛋白序列是否正确,将纯化后的融合蛋白His6-OsCML16-His6经过SDS-PAGE胶分离,并从胶中切取出来,采用胶内胰酶消化方法处理,并获得蛋白多肽样品,最后用蛋白质谱方法对多肽样品进行定性分析。通过蛋白质谱仪分析得到的多肽序列与水稻蛋白数据库进行比对分析,搜索肽段对应的蛋白编号。蛋白定性分析发现有肽段与水稻数据库的蛋白匹配,从图5可看出,在纯化获得的蛋白中鉴定到3条肽段序列(MPQQQQVERPTALAPADAEIER、ITAAELGKVLGR和AAFDVYDVDGDGR)是属于水稻OsCML16蛋白,结果表明外源表达及纯化获得的蛋白即为OsCML16蛋白。

图5 质谱分析鉴定的多肽二级图谱Fig.5 Secondary spectrum of polypeptides identified by mass spectrometry

3 讨 论

水稻有32个CML家族成员,CMLs在细胞内与Ca2+结合引起自身构象变化,结合下游靶蛋白,对植物生长发育和逆境胁迫响应起调控作用[23]。CaM、CML和CDPK等钙感受器蛋白在传递低温引起的Ca2+信号过程中发挥重要作用,并参与植物对低温胁迫响应过程的调控[24]。在基于iTRAQ标记的定量蛋白组学方法挖掘耐冷粳稻品种空育131在低温处理过程的调控蛋白中,发现OsCML16蛋白上调表达[21],该蛋白的低温诱导表达可能参与水稻对冷胁迫的响应。因此,克隆OsCML16基因并获得纯化的外源表达可溶性OsCML16蛋白,对进一步制备和纯化抗体及探究蛋白的生物学功能具有重要意义。

本研究根据pET30a表达载体和OsCML16基因序列,选择限制性内切酶BamH I和XhoI对pET30a载体和PCR扩增产物同时进行双酶切,未产生互补的黏性末端,能防止载体和插入片段自连,确保成功获得序列正确的重组质粒,并将构建好的质粒直接转化到表达菌株;OsCML16基因插入pET30a载体后,通过PCR和双酶切鉴定,目的片段大小约300 bp,与基因的理论大小543 bp存在差异,但在进一步的基因测序中发现DNA序列与理论序列完全一致,可能是由于DNA Marker在凝胶电泳分离上存在差异导致大小不一致。目前,在外源表达蛋白的方法中,原核表达蛋白是最常用且耗时最短的一种体外表达系统。大肠杆菌因具有培养条件简单、实验操作容易、转化效率高和繁殖速度快等优点而成为较广泛的外源基因表达系统[25]。本研究中,采用pET30a表达载体构建了携带组氨酸标签的OsCML16融合蛋白表达载体,并成功表达、纯化获得了目的蛋白;蛋白抗体制备试验通常需要可溶性蛋白,本研究为了获得可溶性目的蛋白,采用28 ℃条件诱导表达,于诱导4 h后用裂解液溶解菌体,并直接使用超声波破碎,离心获得的上清液迅速采用亲和层析方法纯化其中的融合表达蛋白,获得的可溶性蛋白可直接用于后续的抗体制备及抗体纯化研究。

本研究中,纯化获得的融合表达蛋白His6-OsCML16-His6经SDS-PAGE电泳检测其蛋白分子量约30 kD,与理论值25.7 kD相近,而且纯化后的蛋白大部分是目标蛋白,其他杂蛋白含量较少,表明亲和层析方法可成功获得体外表达的OsCML16蛋白;为进一步确定蛋白的序列是否正确,采用蛋白质谱仪对纯化蛋白进行序列分析,与水稻数据库的蛋白比较,检测到的3条多肽有较高的离子强度,属于OsCML16蛋白,进一步验证了外源表达的目标蛋白与水稻OsCML16蛋白序列一致。因此,本研究在体外表达并纯化的OsCML16蛋白可为后续进行蛋白功能研究打下基础。

4 结 论

采用原核表达方法将水稻冷胁迫响应基因OsCML16在大肠杆菌中表达,运用亲和层析技术根据融合蛋白携带组氨酸标签纯化获得融合表达蛋白His6-OsCML16-His6,并以蛋白质谱技术验证该蛋白的序列完全正确,后续可将水稻OsCML16蛋白用于抗体制备及蛋白功能研究。