部分水解瓜尔豆胶对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的作用

李 涛, 许云聪, 陈峻波, 李延啸, 闫巧娟, 江正强,3,*

(1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院/食品生物工程重点实验室(中国轻工业联合会),北京 100083;2.中国农业大学 工学院,北京 100083; 3.中原食品实验室,河南 漯河 462300)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种普遍存在的神经退行性疾病,会导致脑细胞和神经细胞之间的突触连接丧失,从而导致认知能力的逐步下降[1]。AD的特征是在大脑中存在与疾病相关的不同蛋白质聚集物,即β淀粉样蛋白(Aβ)组成的斑块,以及Tau蛋白组成的神经纤维缠结[2]。正常情况下,星形胶质细胞和小胶质细胞通过清理碎片、回收神经递质分子和支持突触间的通信来帮助维持神经元的健康和功能[3]。在AD患者的大脑中,星形胶质细胞和小胶质细胞被激活,产生炎症分子并聚集在蛋白斑块周围。小胶质细胞会释放促炎因子,如白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α,这些炎性因子过度表达引起的神经炎症可导致磷酸化Tau的增加和海马功能的损伤[4]。饮食是保证人体健康的一个重要因素,合理的饮食和营养管理会降低与年龄相关疾病的发病率[5]。不健康的饮食习惯会破坏肠道菌群的平衡引起机体代谢异常和炎症反应等,进而通过肠-脑轴诱发许多慢性疾病,也是导致AD的主要原因[6-7]。因此,健康饮食是缓解AD的一种安全有效的策略。

益生元被肠道微生物代谢,产生多种代谢产物,特别是短链脂肪酸,影响宿主生理健康[8]。研究表明益生元可通过改善抗氧化、降低脑内海马及皮质区Aβ沉积和调节肠-脑轴等途径减轻AD小鼠的认知和行为障碍[9-11]。部分水解瓜尔豆胶(partially hydrolyzed guar gum,PHGG)是瓜尔豆胶通过β-甘露聚糖酶水解制备而成,是一种具有良好益生元活性及多种生理功能活性的水溶性膳食纤维。研究发现,PHGG具有降胆固醇、降血脂和降血糖等利于机体代谢平衡的生理功效[12-13]。同时,PHGG通过调节短链脂肪酸影响脂联素、胰岛素的分泌,进而改善高脂高糖饮食引起的糖脂代谢紊乱[14]。Liu等[15]研究表明,PHGG可通过调节氧化应激和恢复肠道微生物群来改善D-半乳糖诱导的大鼠衰老。研究发现,PHGG作为一种益生元,可被结肠内肠道菌群利用,促进双歧杆菌、乳酸菌和阿克曼菌的生长,增加短链脂肪酸的浓度,从而改善肠道功能[16-18];同时,PHGG能够通过改善机体肠道菌群进而抑制便秘和炎症反应[19-21]。但是,PHGG对APP/PS1小鼠学习记忆能力的改善作用尚未见报道。

本研究拟通过行为学表现、神经元损伤、病理特征蛋白表达和神经炎症等方面,探讨PHGG对AD小鼠学习记忆能力的改善作用及其机理,旨在为研发天然抗AD的食品配料提供新资源和研究基础,并为进一步开发和利用PHGG提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与试剂

雄性SPF级APP/PS1小鼠12只及同窝野生型小鼠(C57BL/6J)6只,8月龄,体质量为(30±2) g,至善健康(北京)医学研究院,实验动物生产许可证编号:SCXK(京)2021-0010。大小鼠繁殖饲料,含有碳水化合物(质量分数50%)、脂肪(质量分数4%)、蛋白质(质量分数20%),北京华阜康生物科技股份有限公司。饲料生产许可证编号:京饲证(2019)06076。

PHGG,北京瓜尔润科技有限公司,生产控制参照GB 1886.301—2018《食品安全国家标准 食品添加剂半乳甘露聚糖》,平均分子质量为2.5×104Da,寡糖(聚合度<7)质量分数为24.9%,总膳食纤维质量分数为90.6%[22];β-肌动蛋白(β-actin)抗体、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)抗体、Bcl-2关联X蛋白(Bax)抗体、Toll样受体4(TLR4)、核转录因子κB-p65[NF-κB(p65)]、β淀粉样多肽1-42(Aβ1-42)抗体、磷酸化Tau蛋白(p-Tau Thr231)抗体,英国Abcam公司;山羊抗兔IgG抗体,艾博抗(上海)贸易有限公司;BCA蛋白检测试剂盒,北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Multiskan FC型酶标仪,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;Nikon Ci-S型倒置显微镜,日本尼康株式会社;BM-19AY型激光共聚焦显微镜,上海彼爱姆光学仪器制造有限公司;Tanon 4800型自动化学发光成像仪,上海天能科技有限公司;XR-XM101型Morris水迷宫行为学测试仪、YLS-17B型避暗穿梭仪,上海欣软信息科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1动物分组及处理

小鼠的饲养温度保持在(25±2)℃,相对湿度保持在50%±10%,灯光始终保持12 h明暗交替状态(7:00至19:00为白昼时间、19:00至次日7:00为黑夜时间)。所有小鼠均饲喂SPF级大小鼠繁殖饲料,饮用水为蒸馏水,保持小鼠自由饮水及摄食。经过1周适应期后,将小鼠随机分为3组:野生型(C57BL/6J小鼠,WT)组,模型(APP/PS1小鼠,AD)组,部分水解瓜尔豆胶(APP/PS1小鼠,PHGG)组,每组6只。根据预实验结果和先前报道[15],设定PHGG组按照小鼠体质量的PHGG干预剂量为1 000 mg/kg,将其添加在水中,野生型组和模型组不干预。采用自由饮水的给药方式,实验周期3个月,期间每天监测并记录各组小鼠的体质量。

实验周期结束后,小鼠禁食16 h,快速解剖,低温取小鼠的脑、肝脏、心脏、肾脏、脾脏等脏器组织并称重,用生理盐水清洗组织。用滤纸吸干后,称质量。部分样品固定于体积分数10%的福尔马林溶液中,保存在4 ℃冰箱,用于形态观察。部分样品冻存于-80 ℃冰箱,用于后续指标分析。

1.3.2小鼠老化评分测定

采用日本京都大学竹田俊男和细川昌则教授制定的老化评分标准[23],评定基于行为学和外观改变的小鼠衰老等级。根据程度不同,每项指标分为0～5共5个等级。

1.3.3水迷宫实验

实验装置为一个圆形不锈钢水池,池壁为白色,将水池分为4个虚拟象限。目标象限的中央位置放直径为10 cm,高为23.5 cm的圆形平台,整个实验期间其位置保持不变,水池中水面高于平台顶端约1.5 cm,水温控制在(21±1)℃,实验期间迷宫周围参照物不变,迷宫上方安置摄像机,同步记录小鼠运动轨迹,实验分为2部分:1)定向航行实验:实验过程中保持平台的位置不变,实验开始时将小鼠面向池壁放入水中,记录其找到平台的时间,即为逃避潜伏期。动物上台10 s后自动停止采集。若小鼠在 60 s 规定时间内未找到平台,则将逃避潜伏期记作 60 s,并人为诱导小鼠到达平台,停留10 s。2)空间探索实验。定向航行实验结束后,撤除平台,将小鼠放入池中,自由探索60 s,记录规定时间内小鼠在虚拟平台所在象限游泳的时间、路程及穿台次数等指标。

1.3.4避暗实验

实验装置有避暗箱,分为明室和暗室,明室上方为钨灯用以照明,暗室底部铜栅除靠近明室的3根外都可以通电,电压为36 V,受接触调压器控制,两室间有一门洞,供小鼠出入。实验分为2个部分,即学习阶段和记忆保持测验。1)学习阶段。实验时小鼠面部背向洞口放入明室,未通电,让其自由活动3 min,再将小鼠赶入暗室,通交流电,小鼠受到电击,其正常反应是跑回明室,以躲避伤害性刺激。每只小鼠训练5 min。2)记忆保持测验。学习阶段完成24 h后,重复测验,保持铜栅处于通电状态,将小鼠面部背向洞口放入明室,记录每只小鼠进入暗室的潜伏期和3 min内的错误次数。

1.3.5组织形态观察

解剖小鼠,取大脑组织,放入体积分数为10%中性福尔马林溶液进行固定,固定48 h后进行苏木精-伊红(HE)和尼氏染色,用倒置显微镜观察H&E和尼氏染色组织切片。

1.3.6蛋白表达分析

冷冻小鼠全脑组织在蛋白裂解缓冲液裂解均质,然后离心收集上层清液。采用BCA蛋白检测试剂盒定量检测蛋白质量浓度。用质量分数12%的SDS-PAGE将等量的蛋白样品(20 μg)分离并转移到硝酸纤维素膜上。然后,膜与一抗[Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB(p65),体积比1∶1 000稀释]在4 ℃下过夜。用洗涤缓冲液洗涤后,用二抗(体积比 1∶5 000 稀释)孵育1 h,用自动化学发光成像系统对蛋白条带灰度进行定量。以β-actin作为内参。

1.3.7免疫组化检测

免疫组化法检测小鼠脑组织中β淀粉样多肽1-42(Aβ1-42)的表达水平。玻片用二甲苯脱蜡,过氧化氢淬火。然后用体积分数为10%正常山羊血清在室温下阻断1 h。切片与一抗(Aβ1-42抗体;体积比1∶100稀释)4 ℃过夜,与二抗(体积比 1∶500 稀释)孵育30 min。采用3,30-二氨基联苯胺(DAB)染色,使用荧光显微镜观察图像。

1.3.8免疫荧光检测

小鼠脑组织经体积分数4%多聚甲醛固定后,进行石蜡包埋、切片、脱蜡和抗原修复,用质量分数为5%牛奶室温封闭处理1 h。采用1∶200稀释 p-Tau Thr231抗体室温避光处理1 h。用体积分数为1%牛奶清洗3遍,每次10 min。将山羊抗兔IgG抗体按稀释比1∶500于体积分数为5%牛奶中稀释,室温避光处理1 h。磷酸盐缓冲液室温避光清洗3遍,每次10 min。用DAPI染液处理15 min,PBS室温避光清洗1遍,加一滴甘油,用盖玻片覆盖于载玻片上,指甲油密封盖玻片和载玻片间的缝隙,置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.4 数据处理

采用Graphpad prism 8软件对结果进行统计分析,所有数据均表示为平均值±标准偏差。组间数据的显著性分析采用一维方差分析(One-Way ANOVA)中的Tukey’s多重比较进行。P<0.05表示数据具有显著差异,P<0.01表示数据具有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 PHGG对小鼠衰老特征的影响

小鼠衰老特征变化见图1。由图1(a)和图1(b)可知,PHGG干预13周引起APP/PS1小鼠体质量和摄食量增加,但差异不显著(P>0.05)。由图1(c)可知,相比WT组,AD组和PHGG组小鼠脾脏和肾脏组织的质量均降低;与AD组相比,PHGG组小鼠脑、脾脏、心脏和肾脏的质量增加。由图1(d)和图1(e)可知,与AD组相比,PHGG干预降低APP/PS1小鼠的衰老程度,其中反应性、脱毛程度和脊柱后凸评分分别降低了38.9%(P<0.01)、31.3%(P<0.05)和35.7%(P<0.05)。

与WT组相比,*表示组间数据差异显著(P<0.05),**表示组间数据差异极显著(P<0.01);与AD组相比,#表示组间数据差异显著(P<0.05),##表示组间数据差异极显著(P<0.01)。

2.2 PHGG对APP/PS1小鼠主动学习记忆的影响

Morris水迷宫的定向航行实验结果见图2。由图2(a)和图2(b)可知,第1天,各组的逃避潜伏期和游动总距离无显著差异。与WT组相比,AD组小鼠的逃避潜伏期和游动总距离随训练天数增加而显著增加;与AD组相比,在第3和4天时PHGG组小鼠逃避潜伏期和游动总距离均显著降低(P<0.05)。第5天拆除平台,Morris水迷宫空间探索实验结果见图2(c)～2(f)。与WT组小鼠相比,AD组在目标象限游动的时间和距离明显减少,穿越虚拟平台的次数明显减少(P<0.01)。与AD组相比,PHGG组小鼠进入目标象限的时间、距离和穿越平台的次数显著增加,增加量分别为81.6%、58.0%和171.4%(P<0.05)。

与WT组相比,*表示组间数据差异显著(P<0.05),**表示组间数据差异极显著(P<0.01);与AD组相比,#表示组间数据差异显著(P<0.05),##表示组间数据差异极显著(P<0.01)。

2.3 PHGG对APP/PS1小鼠被动学习记忆能力的影响

小鼠避暗测试结果见图3。与WT组小鼠相比,AD组小鼠逃避潜伏期显著降低,错误次数显著增加(P<0.01);与AD组小鼠相比,PHGG干预显著增加了AD小鼠的逃避潜伏期,增加量为71.6%(P<0.05),错误次数显著减少了39.1%(P<0.05)。

与WT组相比,*表示组间数据差异显著(P<0.05),**表示组间数据差异极显著(P<0.01);与AD组相比,#表示组间数据差异显著(P<0.05),##表示组间数据差异极显著(P<0.01)。

2.4 PHGG对小鼠神经元损伤的影响

小鼠大脑组织形态学观察结果见图4。由图4(a)可知,与WT小鼠相比,AD小鼠大脑皮层和海马CA1区神经细胞疏松散乱,部分细胞出现结构不清晰的现象,细胞形状发生改变,呈现不规则齿状形态。与AD模型小鼠相比,PHGG组小鼠锥体细胞排列整齐,细胞形态较完整,核仁清晰。由图4(b)可知,大脑皮层和海马区神经元数量均显著增加,增加量分别为76.1%和30.8%(P<0.05)。由图4(c)和图4(d)可知,与AD模型小鼠相比,PHGG组显著降低了小鼠大脑皮层和海马区神经元的损伤,表现为神经细胞数量均显著增加,增加量分别为47.4%(P<0.01)和19.0%(P<0.05)。由图4(e)和图4(f)可知,免疫印迹实验结果表明:与WT小鼠相比,AD小鼠全脑组织中Bcl-2/Bax蛋白表达比率显著下降;而与AD组小鼠相比,PHGG干预组显著增加了54.9%(P<0.05)。

与WT组相比,*表示组间数据差异显著(P<0.05),**表示组间数据差异极显著(P<0.01);与AD组相比,#表示组间数据差异显著(P<0.05),##表示组间数据差异极显著(P<0.01)。

2.5 PHGG对小鼠大脑Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表达的影响

小鼠大脑组织HE染色结果见图5。由图5(a)可知,与WT组相比,AD组APP/PS1小鼠大脑组织有大量的Aβ1-42斑块沉积。小鼠大脑组织尼氏染色结果见图5(b)。然而,PHGG干预组较AD组小鼠大脑皮层和海马区Aβ1-42蛋白表达量显著降低,降低量分别为32.0%和55.0%(P<0.05)。小鼠大脑组织中Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表达水平见图5(c)和图5(d)。AD组小鼠大脑皮层和海马区磷酸化Tau(Thr231)蛋白表达量较WT组小鼠显著升高(P<0.01)。与AD组相比,PHGG组小鼠大脑皮层和海马区磷酸化Tau蛋白表达水平分别下降了52.3%和62.6%(P<0.01)。

与WT组相比,*表示组间数据差异显著(P<0.05),**表示组间数据差异极显著(P<0.01);与AD组相比,#表示组间数据差异显著(P<0.05),##表示组间数据差异极显著(P<0.01)。

2.6 PHGG对小鼠大脑TLR4/NF-κB信号通路的影响

小鼠大脑组织中TLR4和NF-κB蛋白表达水平见图6。与WT组相比,AD组APP/PS1小鼠全脑组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达水平显著增加(P<0.01)。然而,PHGG干预显著下调了TLR4和NF-κB蛋白的表达,降低量分别为42.0%(P<0.05)和46.8%(P<0.05)。结果表明,PHGG抑制了AD小鼠全脑组织中TLR4/NF-κB信号通路的表达。

与WT组相比,*表示组间数据差异显著(P<0.05),**表示组间数据差异极显著(P<0.01);与AD组相比,#表示组间数据差异显著(P<0.05),##表示组间数据差异极显著(P<0.01)。

3 讨 论

AD与各种脑功能障碍有关,主要病理特征包括记忆障碍、神经元丧失、Aβ斑块沉积和过度磷酸化Tau蛋白缠结聚集[24-25]。益生元促进了肠道有益菌及其代谢产物的产生,进一步调节肠道免疫和黏膜稳态,从而有效地改善阿尔茨海默病[26-27]。APP/PS1小鼠作为一种理想的AD动物模型,6月龄时大脑开始出现Aβ斑块沉积并表现出认知功能障碍[28]。PHGG作为可溶性膳食纤维,具有改善肠道健康的生理作用[29]。研究表明,PHGG通过改善肠道菌群来抑制炎症、非酒精性脂肪肝或衰老[15,21,30]。因此,PHGG可能会通过调节肠道菌群来改善阿尔茨海默病。本研究则主要探讨PHGG独立于肠道菌群对APP/PS1小鼠的改善作用。

记忆力的减退和丧失是AD的主要表现[31]。水迷宫和避暗实验结果表明,膳食补充PHGG显著改善了APP/PS1小鼠的学习和记忆障碍,表现为进入目标象限的时间、距离和穿越平台的次数增加了81.6%、58.0%、171.4%;进入电场错误次数降低了39.1%(图2和图3)。水迷宫实验表明,巴戟天寡糖干预APP/PS1小鼠进入目标象限的时间仅增加了31.7%[32]。神经元是神经系统的功能单位,也是学习记忆的结构基础[33]。本研究PHGG干预显著增加了APP/PS1小鼠大脑皮层和海马区神经元数量[图4(b)和图4(d)]。海马区是学习和记忆等高级神经活动的重要区域。海马区神经元细胞数量的减少会影响树突棘的形成,进而引起突触可塑性变化,从而影响学习和记忆能力[34]。研究表明,摄入广西长寿老人饮食的膳食纤维复合物能够抑制小鼠大脑组织海马神经元细胞数量的减少[35]。目前,普遍认为细胞凋亡是细胞死亡最常见的机制。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡蛋白和促进凋亡蛋白,其比率决定细胞凋亡发生与否[36]。PHGG干预导致APP/PS1小鼠脑组织Bcl-2/Bax蛋白表达比率增加了54.9%[图4(f)]。因此,PHGG可能通过改善细胞凋亡来抑制神经元损伤,从而提升APP/PS1小鼠的学习记忆能力。

AD最主要的一个病理学特征是Aβ在大脑中过度积累[37]。Aβ沉积导致神经元数目减少,进而影响突触的传递性和可塑性,损害学习和记忆功能。PHGG干预导致APP/PS1小鼠大脑皮层和海马区Aβ1-42蛋白表达量分别降低了32.0%和55.0%[图5(b)],PHGG可能通过抑制Aβ在脑中的积累来改善神经元损伤。研究发现,龙舌兰果聚糖复合物能够抑制AD小鼠脑中Aβ聚集[38]。磷酸化Tau蛋白在大脑皮层和海马区的聚集反映了AD的发生和发展情况[39]。Tau蛋白过度磷酸化,形成神经纤维缠结,导致神经元死亡[40]。与AD组相比,PHGG组小鼠大脑皮层和海马区磷酸化Tau蛋白表达水平均显著下降[图5(d)],这表明PHGG可通过降低脑组织内磷酸化Tau蛋白水平来抑制神经元损伤进而改善AD。因此,PHGG可能通过降低脑组织内β淀粉样蛋白与磷酸化Tau蛋白水平来抑制神经元损伤,进而改善APP/PS1小鼠的认知障碍。

神经炎症是AD的标志和发病的主要原因[41]。研究表明,TLR4/NF-κB信号通路激活了大脑的神经炎症[42]。PHGG干预抑制了AD小鼠全脑组织中TLR4和NF-κB蛋白的表达(图6),表明PHGG可改善AD小鼠大脑神经炎症。NF-κB可被Aβ激活并促进Aβ产生,而过度激活NF-κB信号通路可增强Tau蛋白缠结[43]。因此,PHGG可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低大脑中β淀粉样蛋白与磷酸化Tau蛋白的表达改善AD小鼠神经元损伤。

4 结 论

本研究从行为学表现、神经元损伤、β淀粉样蛋白与磷酸化Tau蛋白表达和神经炎症等方面,阐明PHGG对AD的改善作用。PHGG改善了APP/PS1 AD小鼠的衰老特征和记忆损伤。同时,PHGG干预增加了大脑皮层和海马区神经元数量,降低了β淀粉样蛋白和磷酸化Tau蛋白表达,抑制了TLR4和NF-κB蛋白的表达。因此,PHGG可能通过抑制TLR4/NF-κB炎症通路降低了大脑中病理特征蛋白的表达进而抑制神经元损伤,从而改善了APP/PS1小鼠的学习记忆能力。PHGG有望作为功能性食品的配料,发挥抗AD的功能活性。