牛蛙源米尔伊丽莎白菌的分离鉴定与药敏试验

向圣汉，赵雨贺，彭治鑫，李俊慧，李伟

（长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434000）

随着蛙类养殖业的兴起，蛙类病害问题也日渐突出。蛙类病害主要有真菌性疾病[1]、细菌性疾病[2]、寄生虫疾病[3]，环境因素也可造成病害发生[4]。在人工养殖环境下，细菌引起蛙类的多种重要疾病。目前已报道的致病菌如脑膜脓毒性黄杆菌（Flavobacterium menigosepticum）可引起牛蛙（Rana catesbeiana）歪脖子病[5]，气单胞菌（Aeromonas sp.）可引起牛蛙红腿病[6]、败血症[7]、腹水病[8]、白内障[9]等多种疾病。不同致病菌可能会导致类似的病症，如迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）[10]、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）[7]、点状产气单胞菌（Aeromonas punctata）、非霍乱弧菌（Noncholera vibrios）[11]等都可引起蛙类败血症。

米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）是伊丽莎白菌属的重要物种，最早分离于Mir 空间站的冷凝水[12]。最近，有相关报道表明，感染米尔伊丽莎白菌的蛙会出现神经系统疾病，造成中枢神经系统损伤和类似于脑膜炎的症状[13]。在多种无尾目两栖动物中报道了米尔伊丽莎白菌感染，导致病蛙出现歪头和白内障等病症。胡瑞雪等[14]和秦振阳等[15]从患歪头病黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）；Lei等[16]从患有歪头、白内障病症的棘胸蛙（Quasipaa spinosa）中分离鉴定的致病病原均为米尔伊丽莎白菌。国外在林蛙（Rana sylvatica）、雨蛙（Hyla viridis）中也有被米尔伊丽莎白菌感染出现歪头症病症的报道[17]。

针对牛蛙歪头、白内障病致病菌的研究历史悠久。陈耀明等[18]首次报道了脑膜脓毒性黄杆菌会引起病蛙歪头和白内障病症。陈会波等[19]报道牛蛙歪头白内障病原是黄杆菌IIb 群（Plavobacterium group IIb）。杨春浩等[20,21]发现嗜水气单胞菌、藤黄葡萄球菌（Micrococcus luteus）和浅黄假单胞菌（Pseudomonas mendocina）都存在于患有歪头白内障病症的牛蛙组织，可能都参与了致病作用。有鉴于此，分离并鉴定牛蛙歪头白内障病病原对于该疾病的预防和控制至关重要。2021 年上半年，湖北荆州江陵县牛蛙养殖场出现大量歪头、白内障症状病蛙，通过分离病原菌、生理生化鉴定、基因序列分析等方法鉴定病原并分析其致病性和耐药性，为该病害的治疗和防治提供了参考资料。

1 材料与方法

1.1 供试牛蛙及主要试剂

试验牛蛙取自湖北省荆州江陵县牛蛙养殖基地。

抗菌药物药敏纸片（批号：20210316）、细菌微量生化反应管（批号：20210422）（杭州微生物试剂有限公司）；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；细菌基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离、纯化和鉴定

患歪头、白内障症的牛蛙用70%的酒精进行表面消毒后，在实验室无菌条件下解剖。用接种环将眼睛和大脑分离的样本接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，于30℃恒温培养箱中培养24h，挑取培养基上长势良好的菌落进行纯化培养，并保存备用。取活化菌体涂片，用革兰氏染色，观察形态特征。根据生化微量反应管说明进行生化鉴定。

提取分离优势菌基因组DNA，对菌株进行16S rRNA 基因和gyrB 基因PCR 扩增。16S rRNA 基因上游引物F 为：5’-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物R为：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；gyrB 基因上游引物F 为：5’-GAAGTCATCATGACCGT TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA3’；下游引物R 为：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTC NACRTCNGCRTCNGTCAT-3’。反应体系为（50 μL）：2×PCR Mix 25 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板2.0 μL，ddH2O 21 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，循环34 次，72 ℃延伸7 min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序得到的基因序列在NCBI中进行BLAST 分析比对，从数据库获得相关属种的16S rRNA 和gyrB 基因序列，找到相似性较高的菌株应用MEGA7.0 软件构建系统发育进化树。

1.2.2 药敏试验

药敏试验采用常规琼脂扩散（K-B）法。将分离菌培养液在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基表面涂布接种，室温干燥10 min 后用无菌镊子取出药敏片紧贴于培养基表面，每个处理3 个重复，然后将培养基倒置放在30 ℃培养箱中培养24 h，取出观察并测定抗生素纸片周围透明圈直径，有透明圈则表示对该药物耐药，根据直径大小判定菌株的耐药强弱。

1.2.3 病原菌生长特性研究

调节初始液体培养基pH 为3、4、5、6、7、8、9。取甘油保存的菌种在牛肉膏蛋白胨培养基上活化后,挑取单菌落于LB 液体培养基中培养12 h，取300 μL 菌液接种到15 mL 不同pH 液体培养基中，于30 ℃、200 r/min 培养8 h 后在紫外分光光度计600 nm 处测定菌液OD 值，表示生物量，每个梯度做三次重复。

用NaCl 调节培养基盐度为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，取300 μL 菌液接种到15 mL 不同盐度液体培养基中30 ℃、200 r/min 培养8 h。每个梯度做三次重复。

1.2.4 产淀粉酶、蛋白酶检测

纯化后的菌株在LB 液体培养基中培养至对数生长期，使用打孔器分别在含0.2%可溶性淀粉和含0.2%脱脂奶粉的LB 固体培养基中等间距打四个孔，其中三孔加入100 μL 菌液，另一孔加等体积LB液体培养基作为对照，30 ℃培养24 h 后向淀粉培养基中加入碘液，观察颜色变化和透明圈大小。

1.2.5 病原菌的致病性试验

纯化后的分离菌株接种到LB 液体培养基中培养12 h，离心收集菌体，用无菌生理盐水将菌株配置成1.0×108CFU/mL 的菌悬液，并将菌液经0.3%福尔马林灭活制备灭活菌液。体质量（242±5）g 的健康牛蛙随机分为三个组，每组60 只，每30 只牛蛙暂养在200 L 的养殖箱里，每天换一次水，正常投喂商品饲料，暂养一周后，一组腹腔注射0.2 mL 108 CFU/mL 细菌，另一组注射等体积经福尔马林溶液灭活的细菌；第三组腹腔注射0.2 mL 0.9%生理盐水。记录30 d 内蛙的外观表现及发病数量。

1.2.6 统计分析

数值以平均值±标准差表示，用SPSS 14.0 软件进行统计学分析。采用单因素方差分析，组间两两比较采用卡方检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 病原菌的菌落形态及生理生化指标

从牛蛙脑组织中分离到多个形态特征相似的菌株，经纯化后筛选到1 株优势菌株，30℃培养24 h 后观察形态特征,进行革兰氏染色。结果显示，菌株长势良好，培养24 h 后菌落直径1～1.5 mm，形状规则，不透明，表面光滑，呈淡黄色。显微镜观察呈杆状，革兰氏阴性。该菌对苯丙氨酸、蛋白胨、葡磷胨、葡萄糖、山梨醇、木糖、棉子糖试验反应呈阴性，对尿素、半固体琼脂、赖氨酸、鸟氨酸试验呈阳性；不能利用葡萄糖酸盐、枸橼酸盐，不能产生硫化氢（表1）。

表1 生化试验结果Tab.1 Biochemical test results

2.2 分子生物学鉴定结果

分离菌株经16S rRNA 和gyrB 的特异性引物扩增产物送生工有限公司测序，所得序列经拼接后在NCBI 数据库中进行BLAST 比对分析。结果表明，分离菌株的16S rRNA 和gyrB 基因序列与Genbank 中其他米尔伊丽莎白菌分离株的同源性高达99.33%～99.93%，对序列比对相似度较高的序列进行筛选后，应用MEGA7.0 软件构建序列遗传进化树，分离株与米尔伊丽莎白菌聚为一支，结果如图1。该结果表明，分离菌株为米尔伊丽莎白菌，菌株编号为Mir-N11，GenBank 注册号CP090369.1。

图1 菌株Mir-N11 的16s rRNA 基因（A）和gyrB 基因（B）序列系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of 16s rRNA gene（A）and gyrB gene（B）of strain Mir-N11

2.3 药敏试验结果

菌株E.miricola Mir-N11 对米诺环素、红霉素高度敏感，对多西环素、环丙沙星、氧氟沙星中度敏感，对哌拉西林、头孢哌酮、麦迪霉素、羧苄西林、万古霉素敏感，对克林霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素等不敏感（耐药）（表2）。

表2 药敏试验结果Tab.2 Drug sensitivity test results

2.4 菌株生长特性研究

菌株Mir-N11 在脱脂奶粉培养基中生长24 h后能明显观察到透明圈，表明Mir-N11 具有较强的产蛋白酶能力（图2-A）；而在淀粉培养基中培养24 h 后用碘液进行染色，在菌落周围未观察到透明圈，表明菌株Mir-N11 没有产淀粉酶的能力（图2-B）。菌株Mir-N11 在pH 3.0～9.0 范围内均可生长，最适生长pH 为6.0（图3-A）；在盐度0.5%～2.5%范围内均可生长，最适生长盐度为0.5%（图3-B）。

图2 菌株Mir-N11 产蛋白酶（A）和淀粉酶（B）能力Fig.2 Protease（A）and amylase（B）production capacity of strain Mir-N11

图3 pH 和盐度对菌株Mir-N11 生长的影响Fig.3 Effects of pH and salinity on the growth of strain Mir-N11

2.5 菌株Mir-N11 致病性验证

活菌注射组的牛蛙在注射后第5 d 开始出现不摄食、歪头、眼球发白、水中转圈等症状，30 d 内累计发病率为43%，而灭活细菌注射组和对照组的牛蛙试验期间未出现发病（图4）。进一步分离表现明显症状的病蛙脑组织细菌，将16s rRNA 基因测序，并在NCBI 上进行序列比对，鉴定为米尔伊丽莎白菌，与自然患病蛙细菌分离鉴定结果一致，这进一步表明，菌株Mir-N11 具有较强的致病能力，是造成此次牛蛙歪头病的病原菌。

图4 不同处理组的牛蛙30 d 内发病情况统计Fig.4 Incidence statistics of bullfrog in different treatment groups within 30 days

3 讨论

蛙类歪头、白内障病病原的研究倍受关注。但伊丽莎白菌属的病原菌分类地位及分类体系的混乱，很长时间以来没有统一蛙歪头、白内障病病原的分类地位。陈耀明[18]报道了脑膜脓毒性黄杆菌会引起病蛙歪头和白内障病症。陈会波等[19]发现，牛蛙歪头白内障病原是黄杆菌。在本研究中，从患有歪头白内障病的牛蛙脑组织中分离得到一株米尔伊丽莎白菌，经生理生化、16s rRNA 和gyrB 基因测序，鉴定其为E.miricola，通过回归感染试验证实了该菌株能引起牛蛙歪头白内障病。

药敏试验结果显示，分离株对哌拉西林、红霉素、多西环素、环丙沙星、头孢哌酮等药物敏感；对克林霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等耐药。秦振阳等[15]的研究显示，从患歪头病黑斑蛙中分离的米尔伊丽莎白菌对链霉素、强力霉素、麦迪霉素等多种药物敏感，对诺氟沙星、氧氟沙星、多粘菌素B等耐药。雷雪平等[16]的研究显示，从患病棘蛙中分离得到的米尔伊丽莎白菌对阿米卡星、阿苄西林、红霉素、庆大霉素、氧氟沙星、四环素耐药，但仅对氟苯尼考敏感。李川北等[22]从患歪头病黑斑蛙中分离的米尔伊丽莎白菌对米诺环素、氟苯尼考、利福平和万古霉素敏感，对青霉素、氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢他啶、头孢克洛等耐药。造成耐药表型不一致的原因可能是耐药基因隐性表达或不表达[23]，或者细菌处于异质性耐药[24]。细菌耐药性的获得与生物膜的形成有关[25]。不同菌株的药敏差异说明不同时间、不同地域养殖过程中抗生素的使用差异可能是菌株耐药性差异的主要原因[26]。

致病菌在生长繁殖过程中会产生多种胞外活性产物，包括胞外蛋白酶、溶血素、明胶酶、脂肪酶、和淀粉酶等[27]。本研究通过平板打孔法初步测定了米尔伊丽莎白菌胞外产物的酶活性。结果表明，分离株Mir-N11 能够产生胞外蛋白酶，但不产生淀粉酶。胞外产物与病原菌致病作用密切相关[28]，能够在一定程度上增加病原菌的毒性[29]。张飞等[30]在研究大黄鱼（Pseudosciaena crocea）发光杆菌（Photobacterium damselae）的致病能力时发现，胞外蛋白酶与明胶酶、淀粉酶等协同作用致大黄鱼患病。金珊等[31]发现，溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的胞外产物中具有明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性及溶血活性，对大黄鱼有直接致死作用。牟海津等[32]在副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的胞外产物中检测到蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶、几丁质酶活性，表明胞外产物在感染对虾的过程中起至关重要作用。许兵等[33]研究表明，导致对虾红腿病的毒力因子是副溶血弧菌和溶藻弧菌的胞外蛋白酶。综上所述，致病菌胞外产物在致病过程中起着重要作用，不同细菌的胞外产物也不尽相同，对于米尔伊丽莎白菌其他胞外产物活性以及在致病过程中的作用还有待进一步研究，以便进一步阐明其致病机理。

结论：分离得到一株强致病菌，经鉴定为米尔伊丽莎白菌。该菌对牛蛙具有较强的致病性和多重抗耐药性；可产生胞外蛋白酶，但不产淀粉酶。本研究结果可为E.miricola 病原流行分析及防治提供参考资料。