Ag负载螺旋碳纳米管修饰电极测定腺嘌呤

王帆，雷蕙疑，冯皓，旷文安,2*，贺灵芝

（1.衡阳师范学院 化学与材料科学学院，湖南 衡阳 421008；2.南华大学附属第一医院，湖南 衡阳 421001；3.湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421005)

腺嘌呤(Adenine)，即维生素B4，又称6-氨基嘌呤，是4种常见核碱基的一种，分子式为C5H5N5。腺嘌呤是一种嘌呤衍生物，抗代谢物核苷的类似物，是所有生物体内核酸组成的最小单元之一，主要以结合态的形式存在，在遗传物质的合成中发挥着重要作用，参与人体的多种生命活动及新陈代谢等，还可以抑制神经递质的释放[1]。腺嘌呤能促进白细胞增殖，增加体内白细胞的数量，当生物体中的腺嘌呤含量变化异常时，机体免疫系统可能会发生缺陷和突变，更会伴随着某些疾病的产生，例如癌症、艾滋病、白血病、心肌梗塞以及急性粒细胞减少症等[2]。因此，开发灵敏、高效的方法来监测生物组织中的腺嘌呤对于疾病预防意义重大。

目前，报道的检测腺嘌呤的方法主要有：高效液相色谱法[3]、液质联用法[4]、毛细管电泳法[5]、荧光光谱法[6]。这些方法存在着检测准确度低、可重复性较差、步骤繁琐、设备仪器昂贵等诸多不足。电化学检测方法不仅成本低廉、操作简单、灵敏性高且易于小型化，其在现场检测方面有更加广泛的应用前景[7]。

在电化学检测应用研究中，催化活性高、选择性好的电极材料直接决定电化学检测方法的灵敏度和稳定性。目前，报道的用于腺嘌呤检测的电极材料主要有纳米Fe3O4修饰多层碳纳米管[8]、纳米铜[9]、银-氯化银[10]等。尽管这些材料在灵敏度和稳定性上有较好的表现，但是开发性能更优越的电极材料满足电化学传感的更高要求仍是一种挑战。

碳纳米材料以其独特的低维结构、奇特的电气、机械和力学性能以及量子尺寸效应，在能源、环境、生物、医药和微波吸收等新兴领域具有许多突出的特性。碳纳米管是由碳原子形成的石墨烯片层卷成的无缝、中空的管体，目前研究较多的是单壁碳纳米管、多壁碳纳米管和双壁碳纳米管[11]，而螺旋碳纳米管(HMWCNTs)研究较少。

本实验首先合成Ag负载螺旋碳纳米管(Ag/HMWCNTs)的新型材料，发现其催化性能优于HMWCNTs。因此将Ag/HMWCNTs分散涂滴在玻碳电极(GCE)表面，再修饰全氟磺酸树脂(Nafion)防止材料掉落，制备Ag负载螺旋碳纳米管修饰玻碳电极(Ag/HMWCNTs/GCE)。基于该电极构建的电化学传感方法在腺嘌呤的检测中展示了较宽的检测范围和较低的检出限，且能用于实际样品中腺嘌呤的检测。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

实验试剂见表1，实验仪器见表2。

表1 实验试剂

1.2 电极材料制备方法

Ag/HMWCNTs的制备：称取HMWCNTs 20 mg，加入10 mL水进行超声分散。称取0.1 g AgNO3，加入5 mL水使之溶解，再加入0.55 mol/L的氨水混合均匀形成银氨溶液。将生成的银氨溶液在搅拌下滴加入HMWCNTs分散液中形成溶液A。称取0.75 g葡萄糖，加入5 mL水使之溶解形成溶液B。在搅拌条件下将溶液B缓慢加入溶液A中，至少搅拌40 min后，再静置60 min，离心、水洗、烘干后得到Ag/HMWCNTs。

1.3 修饰电极的制备

电化学性能的检测采用传统的三电极体系：在处理过的玻碳电极(GCE)(先在打磨台上进行打磨抛光，分别用硝酸、乙醇和水超声，在红外灯下干燥)上均匀涂覆 1 μL Ag/HMWCNTs，后修饰1 μL Nafion 作为工作电极(Ag/HMWCNTs/GCE)。以类似的方法制备螺旋碳纳米管修饰玻碳电极(HMWCNTs/GCE)。以Pt电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极进行测试。每次测试前先将修饰电极通过三组循环伏安法(CV)进行电极的活化，再进行CV、方波伏安法(SWV)、电化学阻抗法(EIS)、计时电量法(CC)的测试。

2 结果与讨论

2.1 物相分析

选用X射线衍射（XRD）分别对Ag/HMWCNTs和HMWCNTs进行物相表征。见图1。将Ag/HMWCNTs图谱与HMWCNTs图谱对比，可以清楚看出，Ag/HMWCNTs与 Ag标准卡片(JCPDS 87-0717)和C标准卡片(JCPDS 41-1487)匹配很好，没有出现多余的杂质峰，特征峰强且窄，即说明该材料除了具有与HMWCNTs的特征峰外，还具有Ag的强烈特征峰；证实了Ag/HMWCNTs的成 功合成；没有其他杂峰说明合成产品的纯度较高。

图1 Ag/HMWCNTs和HMWCNTs的X射线衍射图

2.2 形貌分析

选用扫描电子显微镜（SEM）分别表征HMWCNTs和Ag/HMWCNTs的形貌特征，见图2。相对于HMWCNTs(图2（A）),可以明显看到Ag/HMWCNTs(图 2（B）)在螺旋管状的 HMWCNTs上附着有粒径约200 nm的纳米级金属银。纳米银粒子与HMWCNTs的结合增大了比表面积，高催化活性的Ag纳米粒子可提供更多的催化活性位点。

图2 HMWCNTs和Ag/HMWCNTs的SEM图

2.3 Ag/HMWCNTs/GCE的电化学性能表征

以 5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]和 0.1 mol/L KCl为电化学探针，采用EIS对GCE、HMWCNTs/GCE和Ag/HMWCNTs/Ag负载螺旋碳进行电化学表征，结果见图3。比较3个电极的阻抗半圈直径的大小可以表征电极材料导电性能的强弱。从图3(A)中可以看出，Ag/HMWCNTs/GCE相比其他两种修饰电极的阻抗最小。同时表明，该材料成功地附着在裸电极表面，大大提升了电子转移的能力，改善了其电化学性能，因此Ag/HMWCNTs/GCE的电子传递性能最好。同样，以 5×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]和 0.1 mol/L KCl为电化学探针，采用EIS对GCE、HMWCNTs/GCE和Ag/HMWCNTs/GCE进行电化学测试,结果见图3(B)，然后得到 Q-t1/2图3(C)。根据 Anson 公式[12]计算电极活化表面积(A)。

图3 （A）三种电极的电化学阻抗谱；（B）三种电极的计时电量图；（C）三种电极的Q-t1/2线性关系图

Q与t1/2的回归线性关系见表3。从表3中数据可知，Ag/HMWCNTs/GCE的电极表面积比GCE电极表面积大很多(约为GCE的2倍)，并且也比HMWCNTs的电极表面积大。因此，可以得出将Ag/HMWCNTs修饰在GCE表面后会大大提高电极的活性比表面积。

表3 电极表面积计算

2.4 Ag/HMWCNTs/GCE的电催化性能

为考察Ag/HMWCNTs/GCE对腺嘌呤氧化还原的电催化活性，将 GCE(A)、HMWCNTs/GCE(B)、和 Ag/HMWCNTs/GCE(C)在 1.0×10-3mol/L腺嘌呤溶液中以50 mV/s在-0.5～2.0 V范围作CV扫描，结果见图4。从图4可知，HMWCNTs/GCE和GCE对腺嘌呤的氧化还原产生的催化作用较弱，氧化峰电流分别为 141 μA 和 113 μA；而 Ag/HMWCNTs/GCE具有明显的氧化峰，其峰电流为315 μA，且峰电流增加最为明显，说明Ag/HMWCNTs/GCE对腺嘌呤产生了最优异的催化性能，即可利用该峰对腺嘌呤进行定量检测。

图4 （A→C）不同电极在不含（a）和含有（b）1.0×10-3mol/L腺嘌呤溶液中的循环伏安图；（D）不同电极在1.0×10-3mol/腺嘌呤溶液中的循环伏安图

2.5 pH和富集时间的优化

为了探究腺嘌呤在不同pH条件下在Ag/MWCNT/GCE上的电化学响应效果，将1×10-3mol/L腺嘌呤的B-R缓冲溶液调成不同pH，在0.6～1.2 V的电位范围分别对修饰电极进行SVW，如图5(A)所示。从图5(B)曲线(a)峰电流与pH的变化关系可以看出，在pH=2.0时其峰值最大，故选择pH为2.0。后面的变富集、变扫速时间都以该pH为标准。从图5(B)曲线(b)可知，峰电位Ep与pH成较好的线性关系，Ep=-0.05655 pH+1.16098，该线性关系斜率与Nerst理论值接近，说明腺嘌呤在Ag/MWCNT/GCE上的质子数(m)与电子数(n)的比例为1:1。

图5 (A)Ag/HMWCNTs/GCE 在不同 pH(a→f：1、2、3、4、5、6)中的 SWV 叠图；(B)pH 与峰电流(a)、峰电压(b)的变化关系图；(C)Ag/HMWCNTs/GCE在不同富集时间的峰电流的变化关系图；(D)Ag/HMWCNTs/GCE 在不同富集时间的 SWV 对比关系图(a→e：2 s、30 s、60 s、90 s、120 s)

同样，在1.0×10-3mol/L、pH=2.0的腺嘌呤溶液中以50 mV/s在-0.6～1.4 V范围作CV，在此条件下通过改变富集时间进行检测，富集时间为2～120 s(每隔30 s测试一次)，最终检测结果见图5(C)。由图5(D)可得在2 s时峰电流最大，当富集时间增加，峰电流随之下降。因此最终确定本实验的最佳富集时间为2 s。

2.6 电极过程动力参数计算

使用CV法在不同扫描速率下进行CV扫描，研究Ag/HMWCNTs/GCE修饰电极在腺嘌呤上的电化学参数。图6(A)是在浓度为1×10-3mol/L、pH=2的腺嘌呤溶液中，扫描速率从10 mV/s增加至300 mV/s，对腺嘌呤的CV响应曲线。在扫描过程中，随着速率的增加，电位向正向移动，腺嘌呤的氧化还原峰电流也相应地增加。利用氧化峰的峰电位作线性关系图，见图6(B)，得到线性关系Ep=0.0277 ln V+1.12936，相关系数为0.97817，斜率为0.0277，其中 R=8.314 J·mol-1·K-1，F=96480 C/mol，α=0.7，由公式计算得n=1.58，将计算结果取整数后，电子转移数为2，所以得到腺嘌呤是2电子转移过程。根据实验之前优化条件pH的计算可知，m与n的比例为1:1，由此可知腺嘌呤电极可能的反应机理见图7。

图6 (A)Ag/HMWCNTs/GCE 修饰电极在腺嘌呤溶液(1×10-3mol·L-1、pH=2)不同扫速下的 CV 图；(B)峰电压与扫速的自然对数的线性关系

图7 腺嘌呤可能的反应机理

2.7 线性关系和检出限

利用修饰电极Ag/HMWCNTs/GCE在pH为2.0条件下对腺嘌呤进行浓度梯度检测见图8(A)，发现其浓度在 6.0×10-5～8.0×10-3mol/L 之间与氧化峰电流的对数值成线性关系，见图8(B)，其线性方程为：log ip=0.3697logC-3.9583。根据公式DL=KSb/r，在计算中K取3；DL为检出限；r为灵敏度；Sb为标准偏差；可算得检出限为9.0×10-6mol/L。

图8 (A)Ag/HMWCNTs/GCE在不同浓度腺嘌呤中的方波伏安图；(B)峰电流的对数值与浓度对数值的线性关系

2.8 干扰物对检测的影响

采用SWV法，以0.01 mol/L B-R缓冲液作为支持电解质，对1×10-4mol/L的腺嘌呤进行干扰测试。将加入最大干扰物质稳定的峰电流值与腺嘌呤的稳定峰电流相对比较，求出标准偏差百分比。实验结果见表4，结果说明这些物质对腺嘌呤的电化学检测影响不大。

2.9 电极的重现性

采用SWV法，对Ag/HMWCNTs修饰电极重现性进行考察。取同一支Ag/HMWCNTs修饰电极平行检测pH=2.0的1×10-4mol/L腺嘌呤6次，RSD值为2.54%；说明Ag/MWCNT/GCE对腺嘌呤检测具有良好的重现性。

2.10 实际样品测定

取鸡肝和鸡血为实际样品，加入适量0.01 mol/L B-R缓冲液，对样品中的腺嘌呤进行加标检测，计算出回收率结果见表5。鸡肝中腺嘌呤的回收率为107.7%，鸡血中腺嘌呤的回收率为90.8%；两种实际样品的平均回收率为99.3%；说明此方法可用于实际样品的定量检测。

表5 实际样品回收率

3 结论

基于Ag/HMWCNTs成功地构建了电化学传感方法，并应用腺嘌呤的电化学响应研究，腺嘌呤在Ag/HMWCNTs修饰电极的检测下发现有明显的氧化峰，最终确定了测定腺嘌呤的最佳pH为2.0，最佳富集时间为2 s。在最佳检测条件下，腺嘌呤浓度在6.0×10-5～8.0×10-3mol/L之间与其氧化峰电流有良好的线性关系；检出限为9.0×10-6mol/L。研究方法可用于检测实际样品腺嘌呤的含量，平均回收率为99.3%。