浅析奶源奶及奶制品中尿素鉴定及含量测定方法

◎ 袁 平 ，汪恩婷， 赵壮志， 沈 锐， 赵旭东， 李庭行，覃馨玉

（1.重庆市永川食品药品检验所，重庆 402160；2.重庆市计量质量检测研究院，重庆 402160）

1 鉴别

1.1 样品处理

样品50 g放入烧杯，分别加入乙酸锌溶液及亚铁氰化钾溶液各5 mL摇匀，沉淀静置1 h过滤，用快速滤液来分别进行鉴别。

1.2 浓盐酸鉴别法

用蘸有浓盐酸的玻璃棒靠近加热分解的样品，如果样品含有尿素，则会发出NH4Cl白烟。

1.3 浓硝酸鉴别法

滤液加浓硝酸 50滴，混匀放置 5～10 min，若有白色结晶产生就证明存在尿素。

1.4 硫酸铜鉴定法

滤液20～50 mL放入烧杯，用水20 mL溶解之后过滤，滤液放在电炉上加热，冷却之后，加入100 g /L 氢氧化钠溶液10滴，搅拌均匀，接着加入100 g /L的硫酸铜溶液1滴，若出现紫色，证明含有尿素[1]。

1.5 强碱鉴定法

取5 mL滤液加100 g /L氢氧化钠溶液5 mL，用电炉加热沸腾1 min，如果出现氨味，则证明含有尿素。

2 二乙酰一肟分光光度计法

2.1 原理

试样采用蛋白质沉淀剂去蛋白，用活性炭脱色，二乙酰一肟与尿素在酸性条件下，经过催化进行缩合，在硫氨脲作用下，生成4，5-二甲基-2-1咪唑化合物，于525 nm的吸光度与尿素含量成正比，用分光光度计进行检验，外标法定量。

2.2 试剂

除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为超纯水。冰乙酸；浓硫酸；磷酸：85%；乙酸锌；亚铁氰化钾；硫氨脲；硫酸高铁铵；二乙酰一肟；乙酸锌溶液（106 g/L)，亚铁氰化钾溶液（106 g/L)：酸性试剂；二乙酰一肟溶液（20 g/L)；二乙酰一肟显色液；尿素标液（1 g/L）； 尿素工作标液：分別为0、20、40、80、100、150、200、300 μg/mL的工作标液，现配现用。

2.3 仪器

分光光度计；振荡器；水浴锅。

2.4 分析步骤

2.4.1 样品前处理

根据尿素含量称取试样1～10 g(精确到0.0002 g)于100 mL烧杯之中，加入2.5 g活性炭，再加入乙酸锌溶液及亚铁氰化钾溶液各5 mL，用250 mL容量瓶定容至刻度，搅拌均匀，用快速滤纸过滤，收集滤液作为样品处理液[2]。

2.4.2 样品测定

吸取不同浓度尿素工作标液各10 mL，分别置于50 mL比色管中，加入10 mL二乙酰一肟显色液，于95 ℃水浴中加热20 min（小心摇动4～5次），用中速滤纸过滤，以尿素浓度为零的标准工作溶液作参比，于波长525 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。吸取样品处理液供试溶液10 mL于50 mL比色管中，操作步骤同上。

2.4.3 结果计算和表述

式中：X1为试样中尿素的含量，mg/kg；c为由试样吸光度按标准曲线求得尿素的量，mg；m1为取5 mL试样液相当试样的质量，g。

3 二甲胺基苯甲醛分光光度计法

3.1 原理

对二甲胺基苯甲醛与尿素可形成有颜色的复合物，该复合物420 nm处可用紫外分光光度进行定量比色，从而计算出尿素的含量[3]。

3.2 仪器

同2.3。

3.3 试剂

DMAB（对二甲胺基苯甲醛）显色剂，称取16 g DMAB于1000 mL甲醇中，再加入100 mol/L盐酸；参比溶液 2 mg尿素/10 mL。

3.4 分析步骤

3.4.1 样品前处理

同2.4.1。

3.4.2 样品测定

吸取不同浓度尿素标准工作溶液各5 mL，分别置于25 mL比色管中，加入5 mL DMAB显色剂。制备一空白对照液，吸取5 mL 溶液和5 mL磷酸缓冲液于25 mL比色管中。将所有比色管轻轻充分摇动并置于25 ℃水浴中放置10 min。用空白对照调节吸光度0点。用1 cm比色杯于420 nm处读取各溶液的吸光度值。用吸光度对尿素浓度做谱图，得出一条直线，准确吸取样品处理液供试溶液5 mL于20 mL比色管中，余下操作同上述步骤。每组样品均应带一参比标准（5 mL参比溶液和5 mL 溶液）及一个空白对照液，并于25 ℃水浴中放置100 min。接着，以空白对照液为对照，读取420 nm的吸光度[4]。

3.4.3 结果计算和表述

式中：X2为试样中尿素的含量，mg/kg；c为由试样吸光度按标准曲线求得尿素的量，mg；m2为取5 mL试样液相当试样的质量，g。

4 液相色谱法

4.1 原理

试样用1%乙酸提取，占顿醇荧光衍生化，液相色谱-荧光检测器测定，外标法定量。

4.2 试剂和材料

甲醇，色谱纯；三氯甲烷，色谱纯；乙酸，色谱纯；盐酸；辛烷基磺酸钠；占顿醇（CAS号90-46-0，纯度大于99%）；1%乙酸溶液；1%盐酸溶液；20 mmol/L辛烷基磺酸钠水溶液；占顿醇衍生剂；尿素标准品，纯度大于99%；标准贮备溶液，1 g/L的标准；标准工作溶液，现配现用。

4.3 仪器和设备

高效液相色谱仪，配有荧光检测器；组织捣碎机；均质器；涡旋混合器；离心机。

4.4 试样的制备与保存

样品约500 g，捣碎，混匀，分为2份，装入洁净容器，密封，并注明标记，于-18 ℃冷冻保存。

4.5 测定步骤

4.5.1 提取

称取试样5 g于50 mL具塞离心管之中，加入20 mL 1%乙酸溶液，均质2 min，以3000 r/m离心3 min，提取上清液，过滤。在盛有残渣的离心管中加入20 mL 1%乙酸溶液，均质2 min，再离心过滤。合并提取液用水定容50 mL，混匀，待衍生。

4.5.2 衍生化

准确吸取0.5 mL提取液和各级标准工作液（0. 2、2、20、200、l 000 mg/L)，分 别加入2 mL进样瓶中，依次加入0.4 mL甲醇，50 μL 占顿醇衍生剂和50 μL 1%盐酸溶液，盖紧瓶盖，混匀，衍生5 min，过0.22滤膜后，供HPLC测定。

4.5.3 测定

4.5.3.1 色谱条件

色谱柱C18柱，长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 mm；柱温：35 ℃；流动相：20 m辛烷基磺酸钠水溶液+乙腈；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：激发波长213 nm，发射波长308 nm。

4.5.3.2 定量测定

将衍生后的标准工作液按浓度由低到高依次进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。在上述色谱条件下，尿素衍生物的参考保留时间约为8.0 mm[5]。

4.5.3.3 空白实验

除不加试样外，按上述测定步骤进行。

4.5.4 结果计算和表述

用色谱数据处理机或按下列计算试样中尿素的残留量：

式中：X3为试样中尿素含量，mg/kg；A为样液中尿素衍生物的峰面积；Cs为标准工作液衍生物的浓度，μg/mL；V为样液最终定容体积，mL；As为标准工作液衍生物的峰面积；m4为称样量，g；20为稀释倍数。

5 尿素酶滴定法

5.1 原理

样品在偏酸性的条件下，所含尿素被尿素酶分解为铵盐，用酸滴定，从而得出尿素的含量[5]。

5.2 试剂

尿素酶，0.25 g尿素于40～45 ℃在1 h之内完全分解，按照产品说明保存； 0.02 mol/L及0.1 mol/L盐酸；0.1 mol/L氢氧化钠。

5.3 试验方法

称取样品0.5 g于高型烧杯之中，加入50 mL水，用塑料薄膜封口，超声提取20 min。将高型烧杯放在磁力搅拌器上，边搅拌边滴加0.1 mol/L盐酸（或者氢氧化钠溶液）中和至pH=4.0，加入0.2 g粉碎较细的尿素酶，立即用薄膜封口，置于50 ℃水浴中不时摇晃，30 min后取出冷却到室温，边搅拌边用0.1 mol/L盐酸滴定至pH=4.0，记录0.1 mol/L盐酸消耗体积V1，同时做空白试验，记录消耗的0.1 mol/L体积V0。

5.4 结果计算

式中：60.06为尿素的相对分子质量；X4为试样中尿素含量，g/kg；V1为样品滴定消耗盐酸体积，mL；C2为盐酸标液的浓度，mol/L；V0为空白消耗盐酸体积，mL；m5——称样量，g。