超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法筛查尿液中150种药物与毒物

滕小梅 ,汪 蓉 ,倪春芳 ,梁 晨 ,张玉荣*

(1.青岛海洋生物医药研究院,青岛 266071;2.上海市公安局物证鉴定中心 上海市现场物证重点实验室,上海 200083)

我国吸毒的人数仍处于高位,滥用药物与新型毒品的品种数量持续增长,禁毒工作面临着严峻的形势[1-2]。涉毒案件时有发生,毒物品种广泛,具体案件分析目标物不明确,给案件侦破造成很大的困难。目前的毒物筛查方法远不能满足办案的需要,建立快速、准确的高通量筛查方法具有重要意义。

液相色谱与质谱联用技术已成功应用于宽范围的毒物筛查[3-6]。筛查技术需要强大数据库的支持,与串联四极杆质谱相比,飞行时间质谱具有更高的质量数分辨率和扫描速率[3],不受限于检测化合物的数目,以更高的灵敏度提供了具有非靶向筛选能力的完整质谱数据,因而更适合未知多目标物的筛查。事实上,飞行时间质谱已被证明对于法医毒理学筛查非常有效[7-11]。

血液(血浆、血清)、尿液、胃内容物、唾液、毛发等是涉毒案件中常见的生物检材[12-13],本课题组前期工作[14]已建立超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF/MSE,其中E 是能量energy的简写,MSE技术可以设置两个不同能量通道,同时获得母离子和碎片离子信息)筛查人全血中150种药物与毒物的方法,包含苯二氮艹卓类、抗抑郁药、阿片类、除草剂、杀虫剂等。与血清或血浆相比,尿液取样方便,所含药物与毒物含量相对较高[12,15],本工作进一步完成了筛查尿液中150种药物与毒物,并进行了方法学验证,可为涉毒案件侦破工作提供快速、准确的筛查方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC型超高效液相色谱仪;Xevo QTOF 型四极杆-飞行时间质谱仪,配Lock-spray接口、Masslynx V4.1数据处理系统和UNIFI筛查软件;ELGA Labwater PURELAB型纯化水系统。

单标准储备溶液:准确称取150种化合物标准品,根据不同理化性质采用甲醇或乙腈作溶剂,分别配制成1.0 g·L－1或0.1 g·L－1的单标准储备溶液,保存于－20 ℃。

混合标准溶液:5 mg·L－1,取适量的150种化合物的单标准储备溶液,混合,用甲醇稀释,配制成5 mg·L－1混合标准溶液。

系统适用性溶液:采用10 种不同相对分子质量、极性和化学性质的化合物的混合溶液作系统适用性溶液,10种化合物分别为尼古丁、东莨菪碱、米那普仑、曲普利啶、噻奈普汀、泰必利、丁咯地尔、曲唑酮、氯氮平和奋乃静。使用前将购买的系统适用性溶液用水稀释至100μg·L－1,在每次分析运行开始时进样,以验证仪器性能。

甲醇、乙腈、甲酸和甲酸铵均为色谱纯;四硼酸钠、氢氧化钠、二氯甲烷、异戊醇、乙醚和己烷均为分析纯;试验用水为自制超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm,总有机碳质量分数小于1×10－9)。

使用的150种化合物标准品购自公安部物证鉴定中心、中国食品药品检定研究院、上海市农药研究所等不同标准物质生产厂家。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,3.5μm);柱温50 ℃;样品室温度4 ℃;进样量10μL;流动相A 为含0.1%(体积分数)甲酸的乙腈溶液,B为5 mmol·L－1甲酸铵溶液(pH 3.0);流量420μL·min－1。梯度洗脱程序:0～0.50 min时,A 为13%;0.50～10.00 min时,A 由13%升至50%;10.00～10.75 min时,A 由50%升至95%,保持1.50 min;12.25～12.50 min时,A 由95%降至13%,保持2.50 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子源,正离子全扫描模式,离子源温度120 ℃;毛细管电压3 000 V,锥孔电压25 V;去溶剂气(氮气)流量800 L·h－1,温度450 ℃;锥孔气(氮气)流量20 L·h－1;低碰撞能量6 eV;高碰撞能量10～30 eV;质量数采集范围质荷比(m/z)50～1 000 Da。以亮氨酸脑啡肽(m/z556.277 1)实时进样,校正外界环境造成的质量数偏移,质量浓度为2 mg·L－1,流量为5μL·min－1。其他质谱参数见文献[14]中表1。

表1 保留时间的精密度试验结果(n＝8)Tab.1 Results of test for precision of retention time(n＝8)

1.2.3 筛查条件

采用Masslynx V4.1 数据处理系统和UNIFI筛查软件采集数据和控制仪器。收集150种药物与毒物的保留时间和质谱信息,建立质谱库文本数据,导入UNIFI筛查软件,对未知物进行高通量快速筛查。将数据库中标准化合物的保留时间、母离子及碎片离子信息与实际样品的进行对比,保留时间偏差的绝对值小于0.25 min及质量数偏差的绝对值小于10 m Da的化合物将会自动显示在筛查结果中,即为阳性结果。在每个序列开始时首先进样系统适用性溶液,并根据系统适用性化合物的保留时间和准确质量数偏差来设定筛查的标准范围。

1.3 试验方法

参照文献[14]取250μL 尿液于2 mL 离心管中,准确加入混合标准溶液10μL及pH 9.5的饱和硼酸盐溶液125μL,涡旋混合15 s。将750μL 提取溶剂体积比为50∶30∶20∶0.5的乙醚-二氯甲烷-己烷-异戊醇混合液加入离心管中,涡旋60 s。以转速13 000 r·min－1离心5 min,转移上层(有机层)液体至1.5 mL的离心管中。在50 ℃水浴空气流下挥干,残渣用250μL 初始流动相溶液复溶,涡旋混合,按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱行为和定性分析

以筛查实际案件的阳性结果为例,图1是在仪器工作条件下筛查得到的氟哌啶醇质谱图。

图1 氟哌啶醇的质谱图Fig.1 MS spectra of haloperidol

由图1可知,在低碰撞能量时得到的氟哌啶醇母离子为m/z376.147 4,与理论值m/z376.147 5基本一致;在高碰撞能量时得到的氟哌啶醇碎片离子为m/z165.069 5和358.137 6,与理论值(m/z165.071 1和358.136 9)相符。

150种化合物是根据化合物的保留时间和母离子准确质量数来鉴定的,碎片离子也包含在内,用来提高鉴别的可信度和区分同分异构体的可能性。在本工作测定的150种化合物中,共有13组同分异构体。基于不同的保留时间或独特的碎片离子,13组同分异构体中的10 组可以成功地彼此区分;其余3组同分异构体,即麻黄碱和伪麻黄碱、倍他米松和地塞米松、吗啡和氢吗啡酮不能通过上述方法具体区分。

2.2 保留时间的精密度试验

取空白尿液,添加系统适用性溶液(100μg·L－1),并按试验方法测定,用于评估保留时间的重现性。通过分析同一日8次进样及连续8日每日进样一次的尿液样本数据,计算保留时间的相对标准偏差(RSD),以考察系统适用性化合物保留时间的日内和日间精密度,结果见表1。

2.3 选择性试验

取空白尿液、混合标准溶液、加标尿液(加标量为25.0μg·L－1),按试验方法测定,以各目标物保留时间、母离子及碎片离子信息进行定性分析。结果表明,空白尿液背景未见内源性物质干扰,加标尿液与混合标准溶液中化合物的保留时间及离子对信息一致。

2.4 残留试验

进样一针高浓度水平(质量浓度为200μg·L－1)的尿液后,再进3 针空白溶剂,考察化合物在整个检测系统的残留情况。结果显示,第一针空白溶剂进样后发现普拉西泮和普罗帕酮有残留,但后续两针空白进样后没有再出现。因此,筛查遇到这两种化合物时,需要加一针空白溶剂。

2.5 基质效应和提取回收率

选取68个化合物作为代表性化合物,这些化合物的保留时间贯穿150种化合物的出峰位置。考察了68个化合物在尿液中的基质效应和提取回收率(RE)。基质效应包含绝对基质效应(a ME)和相对基质效应(r ME)。试验采用绝对基质效应来评估基质对化合物质谱信号的抑制或增强程度。

取空白尿液,按试验方法处理样品,收集上层有机溶剂,在有机溶剂中加入标准溶液,摇匀,于50℃水浴空气流下挥干,残渣用250μL初始流动相溶液复溶,按试验方法进行测定,各分析物的峰面积记作A;取标准溶液于50 ℃水浴空气流下挥干,然后用250μL初始流动相溶液复溶,按仪器工作条件进行测定,各分析物的峰面积记作B;按照a ME＝A/B×100%计算绝对基质效应。

取空白尿液,加入标准溶液,按试验方法处理样品,并进样测定,各分析物的峰面积记作C,按照RE＝C/A×100%计算提取回收率。结果见表2。

表2 基质效应和提取回收率Tab.2 Matrix effect and recovery of extraction

试验所建立的筛查方法是初筛尿液中药物与毒物的定性方法,本课题组前期已建立全血基质的筛查方法[14]。全血与尿液都是常见的生物检材,考虑到实际案件的应用,不同生物检材采用相同的方法,操作简单,且有利于推广,因此试验采用与血样一致的样品前处理方法来处理尿样。由表2可知,该方法的绝对基质效应为23.1%～119%,平均值为69.5%;提取回收率为30.8%～115%,平均值为84.6%。尿液主要成分是水(质量分数96%～97%)、无机盐(主要是钠盐和氯盐)和有机物(主要是尿素,还含有少量的糖类、蛋白质、酶、性激素等)[3],主要的干扰成分是无机盐[16];另外,尿液中含有的各种酶会使部分目标物发生酶解。尿液中一些化合物的绝对基质效应较明显,可能是因为一些内源性物质(如无机盐、酶)未完全去除干净而造成的。

通过计算6个来源空白尿液基质得到的A/B的变异系数,得到化合物在不同批次尿液基质间的相对基质效应。结果表明,除地芬诺酯(相对基质效应40.7%)、甲基麻黄碱(相对基质效应19.1%)外,其他化合物的相对基质效应均小于15%,说明化合物在不同批次尿液中受到的基质影响差异小。

综上可知,对于多种药物与毒物的同时测定,这些化合物的基质效应和提取回收率还是可以接受的,说明本方法仍不失为一种可行的检测方法。

2.6 检出限

在空白尿液中添加不同质量浓度的混合标准溶液,化合物在尿液中的质量浓度分别为0.2,1.0,5.0,25.0,100.0,200.0μg·L－1,按试验方法对上述溶液处理后进样分析。以3倍信噪比(S/N)计算各化合物的检出限(3S/N),结果见表3。

表3 检出限Tab.3 Detection limits

由表3 可知:150 种化合物的检出限为0.2～25.0 μg·L－1,其中112 个化合物的检出限为0.2μg·L－1,20 个化合物的检出限为1.0μg·L－1,13个化合物的检出限为5.0μg·L－1,5个化合物的检出限为25.0μg·L－1。

2.7 稳定性试验

在空白尿液中添加混合标准溶液(各化合物的质量浓度均为25.0μg·L－1),考察了不同条件下样品的稳定性,包括短期稳定性(将尿液样品于室温存放7 h)、长期稳定性(将尿液样品于－20 ℃存放10 d)、处理后进样器放置稳定性(尿液样品经处理后在自动进样器中于4 ℃存放24 h)和冻融稳定性(将尿液样品于－20 ℃存放24 h,取出置于室温下30 min,将尿液样品溶解后再于－20 ℃存放24 h,如此重复冻融3个循环,第3个循环时进行测定)。

结果表明:O3-单乙酰吗啡、敌百虫、海洛因和普拉西泮于室温存放7 h不稳定;氯硝西泮、东莨菪内酯、乙草胺、鱼藤酮、奥沙西泮、海洛因、O3-单乙酰吗啡于－20 ℃存放10 d后发生部分降解;除福尔可定、氯丙嗪和硝西泮外,所有化合物在自动进样器中于4 ℃存放24 h后均保持稳定;O3-单乙酰吗啡在3次冻融循环条件下降解。对于上述化合物的更优储存条件还需进一步研究。

2.8 实际案例分析

将建立的筛查方法用于实际案例分析。筛查120个尿液实际案例,共有10个样品(1＃～10＃)呈阳性(咖啡因没有统计),分别为氯胺酮和去甲氯胺酮(1＃)、氯硝西泮(2＃)、吗啡(3＃)、地西泮和去甲基安定(4＃)、氯硝西泮和阿普唑仑(5＃)、甲基安非他明(6＃)、可卡因(7＃)、东莨菪碱(8＃)、阿普唑仑和α-羟基-阿普唑仑(9＃)、氟哌啶醇(10＃)。用气相色谱-质谱联用仪对筛查的阳性样品进行了验证,证明了UHPLC-Q-TOF/MSE方法作为日常筛查工具的适用性。

本工作建立了尿液中150种药物与毒物的筛查技术,采用相同的样品前处理、色谱系统和检测系统,新的化合物可以很容易添加到筛查方法中,方法快速简单、准确可靠,有利于推广。另外,涉毒案件复杂,涉及的生物检材多种多样,下一步工作将开发其他基质中药物与毒物的检测手段,并进一步扩充筛查数据库,为涉毒案件侦破工作提供准确、高效的多未知目标物筛查技术,提高办案效率。