不同溶剂提取法对韭菜活性物质含量及其功能的影响

胡建业,洪若菲,魏秀武,韩雨燕,洪 军

(1.河南城建学院 生命科学与工程学院,河南 平顶山 467036;2.河南工业大学 国际教育学院,河南 郑州 450001)

韭菜属百合科多年生宿根草本植物,其根、茎、叶、花和籽都具有重要的药用价值和营养价值,具有补肾温阳、行气理血、润肠通便、益肝健胃等药理作用。已从韭菜中分离提取到含硫化合物、黄酮类化合物、甾体皂苷类化合物、含氮化合物、植物油类、维生素、微量元素、蛋白质、多糖等化学成分[1]。对韭菜功能研究报道较多,韭菜醇提物具有较好的抑菌效果,如100%韭菜醇提物对沙门氏菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等都有一定的抑制作用,其中对大肠杆菌的抑菌作用最强,不同菌株之间的抑菌效果有显著性差异,且韭菜醇提物中含有丰富的硫醚类及酯类化合物,其中硫醚类化合物占了总样品组分的27.39%,这些硫醚类化合物可能是韭菜抑菌作用的主要活性物质[2]。赵刚等[3]研究表明在离体条件下韭菜水提液对苹果轮纹病菌菌丝生长具有显著的抑制作用。在韭菜的抗氧化作用中,孙志勇等[4]采用乙醇浸润萃取韭菜叶及韭菜籽中活性物质,结果表明韭菜籽及韭菜叶醇提物对DPPH自由基和羟基自由基都有较强的清除能力。也有报道表明韭菜提取物(70%乙醇提取)可以使大鼠血清中的总胆固醇含量下降约38%,甘油三酯含量下降15%,但高密度脂蛋白胆固醇增加不显著,表明韭菜提取物对辅助降血脂有一定的作用[5]。关于韭菜水提物和醇提物活性成分及其功能差别的研究较少。

为探讨不同溶剂提取工艺对活性成分及功能的异同,以韭菜为研究对象,根据相似相溶原理,分别采用水提法和醇提法提取韭菜中活性物质,确定其多糖、蛋白质和黄酮的含量,并对其不同提取物的抑菌率、降血脂及抗氧化能力等方面进行研究,为韭菜的应用提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

韭菜(市售);乙醇、蒽酮、硫酸、葡萄糖、30%H2O2、抗坏血酸、硫酸亚铁、无水亚硫酸钠、水杨酸、氢氧化钠、氯化钠、盐酸均由洛阳市化学试剂厂提供;考马斯亮蓝由天津市光复精细化工研究所提供;牛血清白蛋白由北京索莱宝科技有限公司提供;琼脂粉、酵母粉、蛋白胨由西亚化学科技(山东)有限公司提供;DPPH由上海麦克林生化科技有限公司提供;猪胆盐、牛胆酸钠、脱氧胆酸钠均由上海源叶生物科技有限公司提供。

供试菌株:金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922、绿脓杆菌CGMCC1.2620,均由本实验室保存。

1.2 主要仪器与设备

GFL-125型烘箱(天津莱博特瑞仪器设备有限公司)、RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、HWS12型恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)、KQ5200DE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)、Genesys 10S型紫外分光光度计(赛默飞世尔科技公司)、酶标仪(美国PE公司)、立式高压蒸汽灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)、超净工作台(苏静集团苏州安泰空气技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 韭菜活性物质的提取

取新鲜韭菜清洗,将韭菜叶切成长约3～5 cm小段,放置于45 ℃烘箱中烘干。48 h后取出粉碎,过40目筛。称取一定量韭菜粉末,按液料比201 (mL/g)的比例加入体积分数为95%的乙醇进行超声处理,设置超声温度为60 ℃,超声时间为60 min,超声功率为200 W,提取韭菜脂溶性物质,即韭菜醇提液[6-7]。韭菜水溶性物质的提取工艺与之相似,用蒸馏水替代乙醇溶液。然后通过真空抽滤去渣,将抽滤液通过旋转蒸发仪浓缩至0.5 g/mL,装入棕色密封瓶放置于4 ℃冰箱保存备用。用前将韭菜水提液和醇提液分别用蒸馏水和乙醇稀释10倍,得到0.05 g/mL溶液,备用。

1.3.2 韭菜不同提取物中活性成分的含量测定

以葡萄糖为标准品,采用蒽酮-硫酸比色法在625 nm处用酶标仪测定多糖含量[8],并绘制标准曲线。以牛血清白蛋白为标准品,采用考马斯亮蓝法在595 nm下用酶标仪测定蛋白质含量[9]。以芦丁为标准品,采用硝酸铝显色法在510 nm处测定黄酮含量[10]。

将韭菜水溶性和脂溶性提取液按标准曲线制备方法进行测定,每个样品设置3个重复;将吸光值代入标准曲线,分别计算水溶性和脂溶性提取液中的多糖、蛋白质和黄酮含量。

1.3.3 韭菜活性物质的功能研究

1.3.3.1 韭菜不同提取物的抑菌活性测定

采用微量肉汤法检测韭菜活性物质的抑菌率。将制备的韭菜水溶性和脂溶性提取物稀释液再稀释10倍,即0.005 g/mL,进行过滤除菌。取培养后对数生长期的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌菌悬液,将菌悬液用液体培养基稀释至106CFU/mL,取菌悬液160 μL,加入提取液40 μL,置于96孔板中;用菌悬液作阳性对照、以液体培养基作空白对照,每样品设置3个重复。将96孔板置于37 ℃,70 r/min恒温振荡器中培养18～24 h,观察微生物生长情况,在600 nm处测量吸光度,分别计算提取物的抑菌率[11]。

1.3.3.2 韭菜不同提取物的抗氧化活性测定

(1)不同提取物对DPPH自由基清除能力的测定。

在10 mL的具塞试管中加入1 mL 0.05 g/mL的提取液和4 mL DPPH试剂(6.5×10-5mol/L醇溶液),在517 nm下测量吸光度,记为A1;用1 mL乙醇溶液代替提取液,做空白对照记为A0;测量1 mL无水乙醇溶液与相同体积提取液的吸光值,记为A2。

以相同浓度的抗坏血酸溶液作为阳性对照,将以上溶液在避光条件下反应30 min后用酶标仪测量相应的吸光度。每个样品设置3个重复,求平均值以减少误差,计算水提液和醇提液对DPPH自由基的清除效果[12]。计算公式为DPPH自由基清除率%=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

(2)不同提取物对羟基自由基清除能力的测定。

先加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液于10 mL的具塞试管中;再加入1 mL 0.05 g/mL韭菜提取液;最后加入1 mL 0.1 mol/L H2O2溶液。将试管置于37 ℃水浴锅中温水浴30 min处理,在酶标仪510 nm处测量吸光度A1,以同体积蒸馏水代替提取液样品的吸光度为A0,以同体积蒸馏水代替H2O2溶液的吸光度为A2。在同样条件下,以相同浓度的抗坏血酸溶液作为阳性对照。每个样品设置3个重复,计算水提液和醇提液对羟基自由基的清除能力[13]。计算公式为羟基自由基清除率 %=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

1.3.3.3 韭菜不同提取物的降血脂功效

以猪胆盐、牛胆酸钠、脱氧胆酸钠作为3种胆酸盐试剂,在10 mL的离心管中加入1 mL提取液和4 mL胆酸盐试剂(0.3 mmol/L,用0.1 mol/L NaOH调pH至6.3),37 ℃恒温振荡1 h,后取出在6 000 r/min的离心机中,离心10 min。取上清液2.5 mL于20 mL的试管中,缓慢加入7.5 mL 60%硫酸溶液,轻轻摇匀,于70 ℃水浴锅中水浴20 min,取出后再冰水浴5 min,最后在387 nm处测量吸光值A1,以蒸馏水代替提取液做空白组A0,以蒸馏水代替硫酸溶液作为对照组A2。每组设置3个平行实验,计算提取液对猪胆盐、牛胆酸钠、脱氧胆酸钠的结合率[14]。计算公式为结合率%=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

2 结果与分析

2.1 韭菜提取物中活性成分的含量

根据测得相应浓度下的标准品溶液的吸光度,获得葡萄糖的标准曲线回归方程为y=0.991 7x+0.117 2,R2=0.991 7;蛋白质标准曲线回归方程为y=0.529 5x+0.280 6,R2=0.992 7;黄酮标准曲线回归方程为y=0.010 8x+0.023 4,R2=0.995 2。根据以上回归方程,将不同提取液测量的OD值代入相应标准曲线,分别测得韭菜提取物中活性成分含量,如表1所示。

表1 韭菜不同提取物中活性成分含量 mg/g

由表1可知,韭菜水提液中多糖的含量显著高于韭菜醇提液,说明韭菜中的多糖易溶于水,且多糖含量丰富;水提液中的蛋白质含量较韭菜醇提液稍高,但差别不明显。说明韭菜中的蛋白质种类丰富,既有水溶性蛋白,又有脂溶性蛋白;而韭菜水提液中的黄酮含量少于醇提液中的黄酮含量,但总体上韭菜中黄酮含量占比较少。此结果与刘华等[15]研究的在最优提取工艺条件下,获得的韭菜和韭黄中提取的总黄酮含量(分别为3.68 mg/g和0.53 mg/g)相比较少,可能与提取工艺、韭菜来源等不同有关,本研究中韭菜醇提液采用95%的乙醇溶剂制备,主要成分是叶绿素。

2.2 韭菜活性物质的功能

2.2.1 韭菜不同提取物的抑菌活性测定

在3种受试菌中,韭菜醇提液的抑菌率均显著高于水提液的抑菌率(见表2),说明溶解在乙醇中的蛋白质、黄酮等成分比溶解在水中的相应成分具有更强的抑菌活性。从韭菜提取液对不同菌株的抑菌活性来分析,韭菜水提液和醇提液在金黄色葡萄球菌中的抑菌率分别是33.90%、60.49%;两种提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌率均低于对另外两种菌株(大肠杆菌和绿脓杆菌)。

表2 韭菜不同提取物的抑菌活性比较

由表2可知,韭菜醇提液的抑菌性强于韭菜水提液,但是韭菜水提液和醇提液对3种菌株抑菌活性的顺序是一致的。这与李洪山等[2]研究100%韭菜醇提物对绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等都有一定的抑制作用相一致,但与崔东亚等[16]提出的韭菜水提液对金黄色葡萄球菌强于大肠杆菌存在偏差,产生偏差的原因推测可能与提取工艺及所用溶剂不同有关。

2.2.2 韭菜不同提取物的抗氧化活性测定

表3为韭菜不同提取物对自由基清除能力比较,韭菜醇提物对DPPH自由基的清除率比韭菜水提物的清除率高,而韭菜水提液对羟基自由基的清除率较韭菜醇提液清除率稍高,但与相同浓度的抗坏血酸相比,韭菜提取液对DPPH自由基和羟基自由基清除率相对较弱。这可能与韭菜水溶性物质和醇溶性物质活性成分差异有关。表明韭菜提取物具有一定的抗氧化能力,但较抗坏血酸的抗氧化能力弱。这与孙志勇等[4]研究乙醇浸润萃取提取韭菜叶及韭菜籽中活性物质表明韭菜的水提液和醇提液都具有明显的抗氧化功能一致。

表3 韭菜不同提取物对自由基清除能力比较

2.2.3 韭菜不同提取物的降血脂功效

体内降低胆固醇的主要途径是与胆酸盐结合,因其可有效排除体内胆汁酸,间接降低胆固醇含量,从而使血脂含量降低。在降血脂实验中,计算韭菜水提液和醇提液对猪胆盐、牛胆酸钠、脱氧胆酸钠的结合率,如图1所示。在3种胆酸盐中,韭菜水提液与胆酸盐的结合率明显高于韭菜醇提液的结合率,表明韭菜水提液的降血脂效果较醇提取液好。一方面说明溶解在水中的降血脂活性成分高于乙醇中的降血脂成分;另一方面可能是由于胆酸盐本身作为盐类物质,其水溶性就高于脂溶性。在3种胆酸盐中,韭菜提取物对牛胆酸钠的结合率均高于另外两种胆酸盐,说明韭菜提取物与含有牛胆酸钠的血脂相结合效果较好。

图1 韭菜不同提取物对3种盐的结合率测定

3 结论

本研究对韭菜水溶性和脂溶性活性物质进行提取,并对提取物的抑菌活性、抗氧化和降血脂能力进行研究。结果表明韭菜水提液中多糖和蛋白质含量较高。韭菜醇提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌的抑菌率较水提液高。醇提液对DPPH自由基的清除率高,而水提液对羟基自由基的清除率高,与抗坏血酸相比,韭菜提取物的抗氧化能力较弱。韭菜水提液对猪胆盐、牛胆酸钠、脱氧胆酸钠的结合率均较醇提液高,表明水提液在辅助降血脂方面效果较好。