鸡毒害艾美耳球虫病防控技术研究进展

陈祥杰,戚南山,廖申权,李 娟,吕敏娜,林栩慧,蔡海明,胡俊菁,张健騑,张浩吉,孙铭飞*

(1.佛山科学技术学院,广东佛山 528000;2.广东省农业科学院动物卫生研究所,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室,广东广州 510640)

鸡球虫病是一种由艾美耳属球虫引起的以肠道严重损伤为特征的寄生性原虫病,该病可造成肉鸡饲料利用率降低、增重缓慢、腹泻甚至死亡等[1],每年给家禽养殖业带来超过100亿美元的经济损失[2]。 目前认为有7种艾美耳球虫能感染鸡,分别是毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)、柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、堆型艾美耳球虫(E.acevulina)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)、早熟艾美耳球虫(E.praecox),其中毒害艾美耳球虫是毒力最强虫种之一。毒害艾美耳球虫寄生在鸡体小肠中段,主要引起8～18周龄的鸡发生急性小肠球虫病,严重时可扩展到整段小肠,剖检可见肠管肿胀和黏膜增厚,肠腔内充满血液。

目前针对毒害艾美耳球虫病的预防和控制主要依靠抗球虫药物和鸡球虫病减毒活卵囊疫苗,但由于临床大量抗球虫药物的低效使用,导致临床虫株几乎对所有现有抗球虫药物呈现不同程度的耐药性[3-4],且当前临床应用的鸡球虫病活卵囊疫苗对于毒害艾美耳球虫仍存在保护力不足等问题,安全高效的防控手段亟待开发。近年来,国内外学者在毒害艾美耳球虫的新型药物开发与疫苗研制等方面开展了大量的研究工作,鉴于此,本文综述了近年来毒害艾美耳球虫病防控技术的研究进展,以期为毒害艾美耳球虫新的抗球虫药物研发及新疫苗的研制提供理论借鉴。

1 毒害艾美耳球虫病防控技术种类及特点

1.1 卵黄抗体防治技术

卵黄抗体(egg yolk antibodies,EYAs)是鸡蛋卵黄中的一种γ免疫球蛋白,是禽类免疫系统中有效的保护性抗体,在母源被动免疫中发挥重要作用,有助于提高禽类的生长性能[5]。通过给蛋鸡多次服用艾美耳球虫孢子化卵囊后采集鸡蛋,从卵黄中提取和纯化卵黄抗体。白细胞介素10(IL-10)是一种有效的抗炎细胞因子,原虫可通过刺激宿主IL-10的上调,逃避宿主的免疫反应,减少炎症反应对于病原体的破坏。研究证明,卵黄抗体可靶向作用于肠腔的宿主肽,可改善因鸡母源抗体传递给雏鸡时引起的全身性抑制IL-10所导致的促炎症状[6]。鸡在口服抗IL-10卵黄抗体可以改善因鸡球虫感染导致的饲料转化率下降及生长抑制,但对卵囊排量无影响[7]。随着卵黄抗体技术的不断进步,该技术将来可配合鸡球虫疫苗使用,改善鸡体的生长及饲料转化效率,改善养殖生产中对于毒害艾美耳球虫病的预防治疗效果。

1.2 药物防治技术

1.2.1 化学类和抗生素类药物 目前已有数十种药物用于防治鸡球虫病,一类是化学合成类药物,如氨丙啉、尼卡巴嗪、托曲珠利、磺胺喹恶啉、地克珠利等药物作用于鸡球虫子孢子和裂殖子阶段,抑制球虫的生长发育[8]。另一类是聚醚类载体药物,包括盐霉素、拉沙里菌素、莫能菌素、马杜霉素等药物,主要作用于鸡球虫无性生殖阶段,通过扰乱球虫体内阳离子浓度,破坏细胞膜内外正常渗透压。自1954年球虫抗药性问题的出现及公众要求减少食物链的药物残留,促使科学家寻求天然、安全和有效的替代化合物。

1.2.2 植物提取物及中草药制剂 植物及中草药制剂作为抗球虫病药物的天然替代品之一,具有许多优点。据研究发现,有1200多种植物具有抗原虫活性,其中有一些植物提取物及其制剂可以增强鸡肠道免疫力,抑制鸡球虫和有害菌的增殖且对肠道有益菌有拮抗作用[9-10]。目前研究表明,能对毒害艾美耳球虫有作用的植物提取物及草药制剂见表1。

表1 不同的植物提取物及草药制剂对毒害艾美耳球虫的影响

1.2.3 纳米药物 纳米药物递送系统(nano drug delivery system,NDDS)是指将治疗药物与纳米载体材料复合形成的纳米药物载体复合物。纳米技术方法被引入兽医领域,不仅用于疾病诊断,而且还用于治疗和预防[20]。它们在生物医学领域具有研究前景,由于它们的体积小和独特的物理化学特性,可以调节药物释放,靶向给药,以及体内免疫调节。有趣的是,微量元素纳米颗粒显示出抗菌、抗寄生虫和抗氧化的作用[21]。

制备含托曲珠利聚合物纳米胶囊,通过饮水作用于鸡体,攻虫后发现饮水中加入纳米胶囊的抗球虫效果与含托曲珠利的参照药物相似,均可有效减少肠道病变计分和卵囊排出量,且72 h内对鸡成纤维细胞没有毒性[22]。氧化锌纳米颗粒的抗球虫效果与地克珠利相似,能有效降低死亡率、肠道损伤及卵囊排出量[23]。氧化锌纳米颗粒能够改善黏膜绒毛的作用面积及隐窝深度,从而提高肠道吸收能力,因此氧化锌纳米颗粒可能具有促生长作用。 抗球虫药物与纳米载体形成的复合物是一种具有潜力的预防控制鸡球虫病、改善家禽健康以及生产性能的替代措施。

1.3 辅助性防治技术

1.3.1 益生元和益生菌 益生元被定义为不可消化的寡糖,是肠道微生物区系的有效调节剂,能选择性地促进体内有益菌的代谢和增殖,刺激新生雏鸡的肠道相关免疫系统,从而保护它们免受疾病的侵袭。相比之下,益生菌是一种活的微生物饲料补充剂,通过改善宿主动物的肠道微生物平衡而对其产生有益影响。自2006年欧盟提出“禁抗”以来,益生元及益生菌有望成为鸡球虫病防治中替代抗生素的方法之一。

在日粮中添加1×108CFU/g的植物乳杆菌P8,有助于改善因包括毒害艾美耳球虫在内的多种艾美耳球虫混合感染导致的高死亡率、卵囊排出量及肠黏膜损伤程度[24]。把反式低聚半乳糖(Bi2tos)益生元注射入黑羽肉鸡的受精卵中,雏鸡自然感染艾美耳球虫,发现益生元添加组的体重、脂肪酸有一定改善且卵囊排出量减少、肠道损伤降低[25]。在基础日粮中添加益生元(甘露寡糖和β-葡聚糖)和益生菌(枯草芽孢杆菌),后者可以通过竞争性排除沙门氏菌和大肠杆菌等病原体,有助于肉鸡消化器官的发育且能降低饲料转化率[26-27]。在饲料中添加丁酸梭菌配合含有毒害艾美耳球虫的鸡球虫活卵囊疫苗联合免疫肉鸡后,可显著降低卵囊排出量、减轻所有肠道损伤,提高增重率,并提出拟杆菌属、产粪甾醇真杆菌的相对丰度的增加有利于肠道微生物群落对抗艾美耳球虫的感染[28]。在日粮中添加枯草芽孢杆菌配合球虫活卵囊疫苗使用后的肉鸡肠道中小梭文肯菌的丰度显著增加,包括产气荚膜梭菌在内的厚壁菌门细菌丰度降低,可能会改善因球虫入侵造成肠道黏膜损伤而引起的坏死性肠炎[29]。因此,益生菌和球虫活卵囊疫苗联合应用有助于减轻毒害艾美耳球虫活疫苗免疫引起的小肠损伤。

1.4 疫苗防治技术

1.4.1 活卵囊疫苗 几十年来,疫苗一直被用来控制球虫病。目前生产中主要以活卵囊疫苗防治为主,其中强毒活卵囊疫苗有CocciVac-B、CocciVac-D、Immucox等,但难以把握的免疫剂量会导致鸡群具有疾病暴发或产生免疫力不足的风险。减毒活卵囊疫苗有Paracox及国内研制的鸡球虫病四价活卵囊疫苗等,这些疫苗是通过筛选更早熟的艾美耳球虫分离株来完成的,即生命周期更短、繁殖能力更弱的减毒虫株,但具有生产成本高、保质期有限、低温运输及保存、繁殖指数低、存在散毒风险等缺点。

减毒活卵囊疫苗对毒害艾美耳球虫的保护性较低,由于临床上鸡球虫的感染病例中多为几种球虫的混合感染,但并不都是同等程度的感染而产生的“拥挤效应”[30],即在寄生部位相同的种类中,潜在期越短的种类,越有优先增殖的倾向,一个时期多以一种球虫占绝对优势。在毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合感染的情况下,前者的有性繁殖体不能充分发育,因而不能产生卵囊,导致毒害艾美耳球虫减毒活卵囊疫苗无法循环感染鸡体而刺激其产生有效免疫力。用重组基因佐剂pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP配合活卵囊疫苗对鸡进行联合免疫,可有效提高疫苗效果及抗体产生期缩短[20]。因此,临床上的减毒活卵囊疫苗对毒害艾美耳球虫的保护性较低,研发合理高效的疫苗接种策略已成为全球养禽业的当务之急[31]。

1.4.2 亚单位疫苗 亚单位疫苗是将保护性抗原基因通过真核表达或原核表达,最终以多肽或蛋白质制备而成的新型疫苗,具有成分纯度高、稳定性好、生物安全性高等优点,能诱导机体产生体液免疫及细胞免疫,但需要通过加入佐剂和采取不同的免疫策略才能达到较好的免疫效果。肠淋巴细胞中高度表达的鸡抗菌肽cNK-lysin可诱导促炎细胞因子产生免疫调节作用,对毒害艾美耳球虫子孢子有抑制作用[32]。通过原核表达系统获得卵囊壁基本成分中的配子体蛋白EnGAM59免疫雏鸡,发现免疫组的肠道病变有显著改善,且体重和免疫球蛋白IgY水平有明显提升[33]。Enp25、EnSAG、EnMIC13基因在转录水平与蛋白水平呈差异性表达,通过制备重组蛋白免疫动物发现,3种重组蛋白均显示有良好的免疫原性及免疫保护效果,可有效改善肠道病变,明显增加体重及减少卵囊排出[34]。杆状病毒表达系统相较于原核表达系统所表达的外源蛋白能更好地诱发机体产生免疫保护力,可能是外源蛋白的空间结构影响其生物学活性[35]。构建多价多表位亚单位疫苗pET-32a-NA4-1-TA4-1-LDH-2-EMCDPK-1,发现对鸡体免疫重组蛋白后,感染柔嫩、毒害、巨型和堆型艾美耳球虫试验组的肠道病变及增重情况有明显改善,抗球虫指数ACI值在130以上,表明该重组蛋白可提供交叉免疫保护力[36]。鉴于亚单位疫苗有着制备流程简单、易大批量生产、贮存运输方便的优势,多价多表位的亚单位疫苗有望成为鸡球虫病新型防控的重要手段。

1.4.3 DNA疫苗 核酸疫苗是将编码抗原蛋白的外源基因插入到载体质粒中,导入鸡体细胞内,利用宿主表达系统合成抗原蛋白,激活宿主的细胞或体液免疫,以达到预防和治疗疾病的目的。鉴于球虫生长阶段的复杂性,含有多阶段抗原的多表位重组抗原的免疫保护效果比单一阶段的多表位重组抗原的效果好,鸡体能产生更有效的免疫应答。筛选具有保护性的T细胞表位片段构建多表位DNA疫苗,对毒害艾美耳球虫在内的多种鸡球虫产生免疫保护效果,免疫组的体重增加,抗球虫指数均能达到170以上,肠道损伤有明显改善[37];该学者还选择柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段抗原基因SO7及裂殖子阶段的抗原基因MZ5-7 T细胞表位集中的片段来构建多表位DNA疫苗pVAX1-m1-m2-s1-s2,能提供良好的免疫保护效果。T细胞及细胞因子的激活对于鸡体抵御球虫感染是至关重要的,通过构建含有T细胞或细胞因子表位片段的多价多表位疫苗或许是未来研发安全高效DNA疫苗的方向。

2 展望

鸡球虫作为危害肉鸡肠道健康的最重要病原之一,随着集约化养禽业的迅速发展以及减抗替抗的养殖要求,传统的抗球虫药物防控方案危及食品安全,安全高效、经济便捷的新型防治策略研究迫在眉睫,绿色安全的天然抗球虫药物、高效的纳米药物有望成为替代抗生素的新型防控方案。目前大量研究发现鸡球虫入侵关键抗原分子在虫体入侵宿主过程中起着关键作用,鉴于鸡球虫在体内存在不同发育阶段的复杂性特点,选择免疫原性良好且适用于球虫不同发育阶段的保护性抗原构建的多表位亚单位嵌合疫苗具有巨大潜力。随着现代分子生物学技术发展和对鸡球虫致病机制、保护性抗原基因等研究和认识不断加深,新一代抗球虫分子疫苗将为新形势下毒害艾美耳球虫病等多种鸡球虫病防控带来新的希望。