NR5A1基因新突变致46,XY完全性性腺发育不良患者的临床诊治与遗传学分析

摆俊博,娜菲莎·吐尔地,刘开放,迪亚尔·地里木拉提,李 佳

(1.新疆医科大学第一附属医院小儿泌尿外科,乌鲁木齐 830011;2.新疆医科大学儿科学院,乌鲁木齐 830011)

性发育异常(disorder of sex development,DSD)原来称为两性畸形,是指先天性染色体核型、性腺与表型性别的发育异常或不匹配,关于其发病率的数据有限,总体发病率大约为1/5 500～1/4 500。2006年发表的芝加哥共识根据染色体核型将性发育异常分为三大类型:46,XX DSD,46,XY DSD,性染色体DSD[1]。其中46,XY DSD临床表现存在较大的个体差异性,具有高度遗传异质性,故是一系列难以归类、难以诊断的复杂性疾病[2]。46,XY完全性性腺发育不良(46,XY complete gonadal dysplasia,46,XY CGD)又称为Swyer综合征,其表现为女性外生殖器,存在幼稚子宫、输卵管及条纹样性腺,但染色体核型为46,XY。SRY基因为Y染色体上的性别决定基因,当SRY基因启动后,尿生殖脊上未分化的性腺发育为睾丸,若胚胎期SRY基因发生突变,则会出现性腺发育不全。据报道只有10%～20%的46,XY CGD与SRY基因突变有关[3]。有研究在9%的46,XY CGD患者中发现了核受体亚家族5 A组成员1(NR5A1)突变,其具有广泛的临床表型[4]。本研究回顾性分析1例46,XY CGD患者的临床特征,并发现了一种NR5A1新的基因突变,结合国内外文献对其诊断及治疗过程进行总结。

1 对象与方法

1.1 研究对象患者17岁,社会性别女,学生,因“发现外生殖器异常10月”为主诉入院。患者为其母亲第一胎一产,顺产,出生时体质量3 500 g,出生时外阴为女性外观,儿童期身高、体质量、智力等正常发育。至今无月经来潮,乳房发育平坦、乳头发育小,一直未引起重视,因发现外生殖器肥大就诊于我院。父母非近亲结婚,母亲身高163 cm,孕期用药史不祥,父亲因故去世,患者入院时身高170 cm,体质量65 kg,血压124/75 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),面容无特殊,无明显喉结及胡须发育,音色中性偏女性。查体见:外阴发育异常,阴毛稀疏,呈女性分布,阴蒂自体表向上突起约4 cm,阴蒂头稍向下弯曲其上有包皮在背侧堆积,阴蒂两侧有大阴唇,且有色素沉着,阴蒂下方可见尿道口及阴道口,两侧阴阜平坦,腹股沟处未触及包块及性腺样组织(图1A)。妇科超声:子宫位置见一条形低回声与阴道相连,约为4.9 cm×1.1 cm×1.5 cm,中间未见明确子宫内膜线状较强回声,考虑始基子宫、双侧卵巢显示不清;腹股沟超声:双侧腹股沟区未见性腺组织;泌尿系超声:未见肾上腺增生及其他异常;垂体核磁未见异常。骨龄与同龄人相仿。激素检查结果见表1,电解质、肝肾功、血常规均未见异常。染色体核型为46,XY。

表1 46,XY完全性性腺发育不良患者实验室激素检查结果

1.2 遗传学诊断方法

1.2.1临床评估 为明确性腺性质,先后行性腺活检、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gondotropin,HCG)激素激发试验,并在术中探查阴道及尿道长度,查看是否存在共同通道。

1.2.2全外显子组及线粒体组基因检测 通过从受检者样本中提取DNA,构建文库,使用杂交捕获试剂完成目标区域捕获,采用Illumina NovaSeq/MGI DNBSEQ-T7完成高通量测序。通过生物信息学分析,筛选出患者基因组中的可能致病性变异。

1.2.2.1DNA提取 签署知情同意书后,抽取患者和其母亲的EDTA 抗凝外周血2 mL。使用 QIAampDNA Blood Mini 试剂盒(Qiagen,美国)按照步骤提取DNA。

1.2.2.2生物信息学分析 核基因组:利用FastQC软件对原始测序数据进行质控分析;利用BWA软件(v0.7.15-r1140)将所有过滤后的测序序列(reads)比对到参考基因组(GRCh37/hg19);利用Picard软件工具去除重复reads;利用GATK软件工具包(v3.7-0)完成单核苷酸变异(SNVs)和插入缺失变异(Indels)的检出;利用XHMM(v1.0)及CNVkit(v0.8.4)软件进行拷贝数变异(CNVs)的检出;利用Annovar及VEP等软件包进行注释。线粒体基因组:利用trimmomatic对原始测序数据进行质控,去除低质量reads,并用FastQC进行质量评估。剩余的reads用BWA软件与线粒体参考基因组NC_012920.1进行序列比对。使用GATK软件分析基因组中SNV和Indel。使用VEP注释变异,并注释mitomap、MitImpact、Clinvar等数据库的信息。

1.2.2.3致病性变异筛选 测序质控数据主要包括Q20、Q30、GC含量、靶向区域的平均测序深度及平均覆盖度等。为确保检测过程中样本没有混淆或污染,选用27个高频SNP位点作为样本身份标识,在二代测序实验的同时平行对每个样本进行这些SNP位点的核酸质谱检测,以确定样本的唯一性。结合人群基因变异数据库(dbSNP数据库、千人基因组数据库、ExAC数据库、gnomAD数据库及本地数据库)信息,去除MAF>0.01(AD)或MAF>0.05(AR)的高频变异,个别特殊的疾病做特殊的阈值过滤。

2 结 果

2.1 临床评估结果在完善相关实验室及影像学检查后,在全麻下行腹腔镜性腺探查术,术中探查见膀胱后下方可见大小约4 cm×1 cm×1 cm的幼稚型子宫,探查左侧性腺缺如,右侧性腺呈条索状(图1B),取该处性腺上下级及内核,送病理活检。腹腔内探查结束后使用小儿膀胱镜探查尿道及阴道,尿道长度约7.5 cm,阴道内长度约12 cm,未见处女膜组织,尿道及阴道无共同通道。术后病理结果:灰白质组织一块,见曲细精管及增生的间质细胞,曲细精管内未见明确各级生精细胞(图1C),提示性腺为发育不良的睾丸。为进一步评估睾丸组织功能,行HCG激素激发试验,连续3 d肌肉注射绒促性素1 500 IU,第4天复查性激素提示:睾酮为1.20 nmol/L(参考值同前),HCG激素激发试验阴性,说明睾丸组织无功能。

2.2 临床治疗结果经各方评估后,最终行阴蒂缩短成形术+大小阴唇成形术,术后2个月随访外观满意(图1D)。

2.3 全外显子基因组检测结果患者全外显子基因组检测发现位于chr9:127265397染色体上的NR5A1基因出现杂合错义突变,变异信息为:c.205C>T:p.Arg69Cys,患者母亲未携带NR5A1基因变异c.205C>T(图2)。在GnomAD数据库、ExAC数据库、HGMD数据库、千人基因组数据库、本地数据库均未收录该变异,REVEL功能预测软件结果偏向于该基因为致病性变异。

图2 46,XY完全性性腺发育不良患者及母亲NR5A1基因变异c.205C>T Sanger测序验证结果示意图

3 讨 论

46,XY性发育异常疾病复杂、病因多样,可分为雄激素合成异常、雄激素受体异常、睾酮在外周组织代谢异常、抗苗勒管抑制物质(anti-Mullerianhormone,AMH)合成、分泌或其受体异常及性腺(睾丸)发育异常。人类性别最初都是往女性方向发展的,至胚胎第6～9周时在泌尿生殖脊上出现未分化的性腺和两个导管(中肾管、苗勒管)。当Y染色体中SRY因子启动后,未分化的性腺发育为睾丸,随后出现支持细胞及间质细胞,间质细胞分泌的睾酮促进中肾管分化为输精管、附睾等,支持细胞分泌的AMH使苗勒管退化。若SRY因子未启动,中肾管在没有睾酮的刺激下而退化,苗勒管不需要任何激素的作用下发育为输卵管、子宫和阴道的上2/3[5]。若胚胎时期睾丸发育过程中出现停滞或退化,则会出现XY性腺发育不全,分为单纯性腺发育不全和完全性性腺发育不全(Swyer综合征)[6]。Swyer综合征患者的染色体核型为46,XY,胚胎早期睾丸因各种因素未发育,也未能分泌睾酮及AMH,中肾管因缺乏睾酮刺激而无法向男性发育,苗勒管因无AMH抑制而发育为输卵管、子宫及上段阴道,因缺少两个X染色体,故性腺无法发育为正常的卵巢,仅为条索状性腺。目前Swyer综合征具体发病机制仍不明确,相关学说及研究表明该病由多基因引起,常见的为SRY基因出现突变、缺失、异位等[7]。有报道称因SRY基因引起的46,XY CGD仅占15%左右[8]。另有学者研究发现常染色体基因中SOX9、NR5A1、WT1、CBX2、DHH和MAP3K1基因常参与人类睾丸发育过程,它们的突变可能导致46,XY DSD[9]。

NR5A1编码类固醇生成因子1(SF1),是决定性腺发育、睾酮合成的关键基因。NR5A1位于染色体9q33.3上,其基因突变导致46,XY性发育障碍,与睾丸间质细胞异常分化和功能失调有关[10]。在XY胚胎中,NR5A1在GTAT4等多个转录因子协调下,使SRY基因表达升高;在睾丸支持细胞中,NR5A1通过激活AMH基因的表达促进AMH的合成和分泌,后者使苗勒管结构退化,从而阻止了在XY胚胎发育过程中形成输卵管、子宫和上段阴道;而在睾丸间质细胞中,NR5A1促进睾酮合成,使中肾管发育为输精管、附睾和精囊,促进男性化及睾丸下降[11]。

本研究中患者出生后按女性抚养,青春期后乳房发育欠佳,且一直无月经来潮,就诊后查性染色体核型为46,XY,外观为正常女性,阴蒂肥大似男性阴茎,查体见存在阴道口及尿道口,且阴道与尿道之间无共同通道。妇科超声提示存在未完全发育的始基子宫,卵巢显示不清;腹股沟超声提示双侧腹股沟未见性腺组织;术中探查见阴道发育良好,长度约12 cm:性腺活检提示性腺为发育不良的睾丸组织;实验室检查睾酮水平较高,但HCG激素激发试验阴性,进一步证明睾丸功能欠佳[12]。患者全外显子基因检测结果提示:发现位于chr9染色体上的NR5A1基因出现杂合错义突变,变异信息为:c.205C>T,结合性染色体、影像学检查、病理活检及基因检测结果可诊断患者为存在NR5A1基因突变的46,XY CGD。

LIN等[13]对严重雄激素缺乏不伴肾上腺皮质功能不全的患者进行NR5A1基因分析,发现约11%的患者存在NR5A1基因杂合突变。BUONOCORE等[14]对CGD和部分男性化46,XY DSD患者进行了广泛的诊断,发现20%左右患者存在NR5A1基因突变,上述作者均认为NR5A1基因突变是导致46,XY DSD发病的主要病因之一。学者对伴有NR5A1基因突变46,XY DSD患者的研究中发现,其个体间表型差异性较大,患者可表现为如尿道下裂、隐睾、男性不育症、卵巢早衰或完全女性化等不同的临床表型,但此类患者其肾上腺功能常正常[15]。有国内学者在46,XY男性化不足的患者中发现1例SF-1杂合子缺失c.11835delC,其母亲及姐姐 SF-1 基因测序结果正常,父亲的DNA未获得,该患儿表现为重度尿道下裂、外阴呈女性外观、阴道为盲端[16]。结合本研究中患者的临床表现为外阴男性化,存在正常阴道及发育欠佳的子宫,再一次证实了上述研究结果,其原因可能是NR5A1基因变异位点的不同导致氨基酸残基活性不同或NR5A1表达剂量的不一。有研究证实即使同一家系中相同变异都会导致不同临床表现,证明其存在较大差异的外显率[17]。

本研究中NR5A1基因为既往未报道的新变异,变异信息为:c.205C>T:p.Arg69Cys,患者母亲未携带NR5A1基因变异c.205C>T,其父亲因故去世无法进行基因携带检测,不能排除其携带此种基因突变或生殖细胞内存在突变的嵌合体。其在GnomAD数据库、ExAC数据库、HGMD数据库、千人基因组数据库、本地数据库均未收录该变异,REVEL功能预测软件结果偏向于该基因为致病性变异。该突变是在NR5A1基因第5外显子区,使第69位氨基酸由精氨酸翻译为半胱氨酸,我们推测该位点发生突变时,将影响NR5A1蛋白与其配体结合,从而影响靶基因的转录调控,进而抑制了胚胎期性腺发育,导致间质细胞分泌睾酮不足,使男性化发育受到抑制,支持细胞分泌AMH不足导致苗勒管未退化而表现出女性特征。

关于46,XY CGD综合征的治疗,目前国内外统一认为一经确诊,需立即行双侧性腺切除术,并按女性抚养,既往报道Swyer综合征患者性腺恶变率高,常有性腺母细胞瘤、无性细胞瘤及恶性程度更高的胚胎瘤[18]。该类患者在青春期时使用雌激素诱导第二性征,当雌激素达成人水平或出现第一次突破性出血时,需加用孕激素替代治疗[12,19]。本研究中我们根据患者性腺活检、HCG激素激发试验结果,判定患者性腺为发育不良的睾丸组织,因患者阴道发育良好且存在幼稚子宫。考虑到患者即将成年,有自我性别认定的意识,在心理实验室完善明尼苏达多项个性检测后,结果显示患者女性性别认同强烈,在与患者及其家属反复沟通谈话后最终决定行性腺切除术+阴蒂缩短成形术+大小阴唇成形术,术后患者外观恢复良好。我们认为典型的Swyer综合征的难点在于针对临床表型不典型的患者如何选择性别,笔者认为对这些患者一经确诊可切除性腺组织,待患者有性别认同概念时再作出性别选择,医者需要做到关爱患者身心健康、尊重患者的选择,作出符合伦理的性别判断并及时给予心理辅导,在成长过程中需要及时随访性激素水平,根据结果调整性激素,维持第二性征的发育。

综上所述,本研究对1例46,XY CGD患者临床资料进行分析,进一步应用全外显子组及线粒体组基因检测明确诊断,发现了一种既往未报道的新的NR5A1基因突变类型,扩大了NR5A1突变谱,为Swyer综合征的诊断提供帮助。由于该病临床表现多样,发病机制复杂,明确诊断后作出正确性别选择对提高患者生活质量有重要价值。