白花前胡CAL基因的克隆和原核表达分析△

管凤雅，吴君贤，姚金辰，查良平，储姗姗*，谢晋

1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；

2.安徽医科大学 药学院，安徽 合肥 230032

前胡为常见的中药材，来源于伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorumDunn 的干燥根，具有散风清热、降气化痰的功效[1]。野生白花前胡资源主要分布于中国安徽、湖北、河南等地，生长于山坡疏林边、路旁灌丛或半阴性的山坡草丛中。野生前胡生长多年抽薹开花，而栽培前胡个体发育时间大大缩短，一般2 年生就可抽薹开花[2]。抽薹开花前的前胡称为雌前胡，抽薹开花后根木质化，此时采收的前胡称为雄前胡[3]。前胡的质量可能与其雌雄株有关。古代本草均要求前胡在采收时“去雄”，历版《中华人民共和国药典》同样要求前胡应在其未抽花茎时采挖[4]。有研究者通过实验得出抽薹后前胡的品质下降，雄前胡不适合药用的结论[5]。现今，在安徽宁国等前胡的产区，均将未抽薹开花的雌前胡作为药材的来源[6]。早薹已成为影响前胡质量的重要因素之一，研究抽薹开花的调控基因可为解决前胡质量问题提供参考。

MADS-box基因编码的转录因子影响着植物的生长发育，其可以调控植物MADS-box基因家族的不同成员，在植物生长过程中起着不可或缺的作用[7]。随着首个与花生长发育相关的MADS-box基因从拟南芥中成功克隆，越来越多与花发育有关的基因得到了广泛的研究[8]。在拟南芥的发育过程中，维持花分生组织的活性是花器官原基产生的前提[9]，其主要是由APETALA1（AP1）和CAULIFLOWER（CAL）促进和维持[10]，AP1和CAL均为MADS-box基因，在序列上高度同源。AP1在花分生组织、萼片和花瓣的形成中起主要作用；CAL调节AP1[11-13]，影响花分生组织的形成，进一步调控花的生长发育[14-15]。

目前，CAL已在花椰菜、甘蓝[16]等植物中被克隆，而白花前胡CAL基因的研究尚未见报道。本研究通过克隆得到白花前胡开花基因PpCAL1和PpCAL2的一段编码序列（CDS），对其进行相关生物信息学分析，构建了2 个基因的原核表达载体并在大肠埃希菌中表达，分析其在不同生长发育时期和不同组织器官中的基因表达模式，为深入研究开花基因在白花前胡生长发育过程中的作用提供依据。

1 材料

白花前胡来源于安徽省宁国市胡乐镇“宁前胡”种植基地，经中国中医科学院中药资源中心彭华胜教授鉴定为伞形科植物白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn。经鉴定后收集未抽薹和已抽薹白花前胡的叶、根进行后续实验，所有组织样品液氮速冻后于-80 ℃冰箱中备用。

Multifuge X1R 型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher 公司）；ETC821 型聚合酶链式反应（PCR）仪（北京东胜创新生物科技有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra 型电泳仪、CFX96 Optics Module 型实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（美国伯乐公司）；DYCP-31DN 型琼脂糖水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；Alphalmager HP 型凝胶色谱成像仪（美国Protein Simple公司）。

大肠埃希菌Trans1-T1感受态细胞、大肠埃希菌E.coliTransetta（DE3）感受态细胞、切胶回收试剂盒EasyPure Quick gel extraction kit、无缝拼接试剂盒pEASY Uni seamless cloning and assembly kit 均购于北京全式金生物技术有限公司；pET-32a载体购于武汉淼灵生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；反转录试剂盒PrimeScript™ Ⅱ 1ststrand cDNA synthesis kit 和T 载体PMD18-T 购自TaKaRa 公司；即用型磷酸盐缓冲液（PBS）片剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购于Sigma公司；2×Realab Green PCR fast mixture 购自北京兰博利德商贸有限公司。

2 方法

2.1 总RNA提取与cDNA的合成

提取白花前胡叶片总RNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳验证其RNA 完整性。使用反转录试剂盒进行反转录，得到白花前胡的cDNA。

2.2 PpCAL1和PpCAL2基因的克隆

白花前胡PpCAL1和PpCAL2基因来源于本实验室白花前胡转录组数据库 [美国国家生物技术信息中心（NCBI）登录号为PRJNA834850]。根据转录组数据中的基因序列信息，以反转录后白花前胡叶片的cDNA 为模板，分别对PpCAL1和PpCAL2基因开放阅读框（ORF）序列设计特异性引物，进行PCR扩增。上游引物为PpCAL1-F：5ʹ-ATGGGGAGAAA GAAAATAGAAATCA-3ʹ；PpCAL2-F：5ʹ-ATGGGT AGGGGTAGAGTACAGTTGA-3ʹ；下游引物为PpCAL1-R：5ʹ-CTATTGAAGCAACATAAGTGTTT GA-3ʹ，PpCAL2-R：5ʹ-TTATGAATTCATGTGTGAA AGCATC-3ʹ。PCR 扩增产物进行电泳检测、切胶回收，将产物与克隆载体PMD18-T连接并测序。

2.3 PpCAL1和PpCAL2基因的生物信息学分析

利用NCBI ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因的ORF；利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）预测基因编码蛋白理化性质；使用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白质结构域分 析 ；使 用 TMHMM 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）分 析蛋白的跨膜结构域；利用在线工具NPS（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_gor4.html）进行蛋白质二级结构分析；利用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）结合PyMOL 2.2.0 软件预测蛋白质的三级结构；运用DNAMAN 6.0 软件进行同源氨基酸序列比对；应用MEGA 6.0 软件构建neighbor-joining 系统进化树，bootstrap重复次数为1000次。

2.4 PpCAL1 和PpCAL2 基因的原核表达载体构建及表达

根据克隆成功的PpCAL1和PpCAL2基因序列进行引物设计，上游引物为BamHI-PpCAL1-F：5ʹ-AG GCCATGGCTGATATCGGAATGGGGAGAAAGAAA ATAGAAATCA-3ʹ；BamHI-PpCAL2-F：5ʹ-AGGCC ATGGCTGATATCGGAATGGGTAGGGGTAGAGTA CAGTTGA-3ʹ；下游引物为BamHI-PpCAL1-R：5ʹ-CGACGGAGCTCGAATTCGGACTATTGAAGCAAC ATAAGTGTTTGA-3ʹ；BamHI-PpCAL2-R：5ʹ-CGA CGGAGCTCGAATTCGGATTATGAATTCATGTGTG AAAGCATC-3ʹ（下划线表示以BamHⅠ作为酶切位点），进行PCR 扩增，检测，切胶回收。同时对原核表达载体pET-32a 质粒进行BamHⅠ酶切处理，切胶回收，将上述切胶回收产物用无缝拼接试剂盒进行拼接，连接产物转入感受态细胞大肠埃希菌Trans1-T1 中，菌液PCR、测序分析正确后提取重组质粒，将重组质粒转化至表达感受态Transetta（DE3）中，构建转化表达宿主菌。取转化表达菌液接种至含有相对应抗生素的LB 液体培养基50 mL中，加入50%葡萄糖4 mL，37 ℃、200 r·min-1条件下振荡培养至菌液600 nm 处吸光度（A）为0.6～0.8 时，取菌液1 mL 作为未诱导菌液，剩余菌液加入终浓度为0.4 mmol·L-1的IPTG 于16 ℃、200 r·min-1诱导12 h，以同样条件处理pET-32a 空载作为空白对照。取菌液1 mL 于4 ℃、10 000×g离心3 min 弃上清液，加入PBS 1 mL 清洗，清洗后再次离心，弃上清液，加入去离子水40 μL，5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液10 μL，混匀，获得全菌点样液；将剩余菌液以5000×g、4 ℃离心10 min，加入PBS 3～5 mL重悬，重复1次后在冰浴条件下超声破碎10 min，离心，取上清液40 μL，加入5×SDS-PAGE 上样缓冲液10 μL，获得蛋白上清点样液。将上述点样液煮沸10 min后放置室温，进行SDS-PAGE电泳分析。

2.5 PpCAL1 和PpCAL2 基因在雌前胡和雄前胡不同器官表达分析

采用qRT-PCR 对PpCAL1和PpCAL2基因在前胡抽薹开花前（叶、根）和抽薹开花后（叶、根）的表达模式进行分析。每个样品3株，分别提取RNA，TaKaRa 试剂盒反转录获得cDNA。以前胡UBC9基因[17]作为内参基因，利用Primer Premier 5.0 软件设计PpCAL1和PpCAL2基因的荧光定量引物。上游引物分别为qPpCAL1-F：5ʹ-GGCTGACCTTGCCCA ACTAGA-3ʹ；qPpCAL2-F：5ʹ-GAAAGCCAGCTCG ATTCAGC-3ʹ；下游引物分别为qPpCAL1-R：5ʹ-TCCCTGTTATTGTCCATCTC CCT-3ʹ；qPpCAL2-R：5ʹ-CTTTGGCAGAACACTG GATGAA-3ʹ。根据2×Realab Green PCR fast mixture 试剂盒的说明书配制20 μL 的反应体系，放置于CFX96 Optics Module 实时荧光定量PCR 仪中进行扩增，每个样品3个重复。采用2-ΔΔCt法分析结果[18]，计算基因相对表达量。

3 结果与分析

3.1 PpCAL1和PpCAL2基因的克隆及序列分析

白花前胡PpCAL1和PpCAL2基因来源于前胡转录组数据库，使用ORF Finder 对PpCAL1基因（GenBank 注册号：OP157202）和PpCAL2基因（GenBank 注册号：OP157203）序列进行预测分析，预测PpCAL1与PpCAL2分别含645、738 bp 完整的ORF。以反转录得到的白花前胡叶片cDNA 为模板，使用特异性引物进行PCR 扩增，PCR 产物连接至T载体，所得结果与预测结果相符。应用NCBI 网站BLAST 进行白花前胡PpCAL1 和PpCAL2 的氨基酸序列比对。比对可知，PpCAL1 和PpCAL2 与GenBank 中已注册植物CAL 氨基酸序列有较高同源性，其中白花前胡PpCAL1 序列与胡萝卜DcCAL（XP_017243185.1）相似度为60.27%；白花前胡PpCAL2 序列与蓖麻RcCAL（XP_002514623.2）相似度为72.36%。

3.2 蛋白质理化性质分析

对白花前胡PpCAL1和PpCAL2编码的蛋白进行理化性质预测。预测显示，PpCAL1编码214个氨基酸，蛋白质相对分子质量为24 937.29 Da，蛋白等电点为6.47，不稳定系数为54.66，脂肪指数为87.99；预测PpCAL2 编码245 个氨基酸，蛋白质相对分子质量为28 076.88 Da，蛋白等电点为9.05，不稳定系数为63.11，脂肪指数为80.78，可初步推测PpCAL1蛋白为不稳定的酸性蛋白，PpCAL2蛋白为不稳定的碱性蛋白。

3.3 结构功能域与跨膜结构域分析

对PpCAL1和PpCAL2蛋白结构功能域进行分析（图1A、图1B）。结果显示，这2 个蛋白都具有MADS_MEF2_like 和K-box 保守结构域。其中PpCAL1 编码蛋白MADS_MEF2_like、K-box 2 个结构域分别位于2～76、102～173 aa；PpCAL2编码蛋白MADS_MEF2_like、K-box 2 个结构域分别位于2～74、83～173 aa。蛋白跨膜结构域分析表明，PpCAL1 和PpCAL2 氨基酸均无跨膜结构域（图1C、图1D），由此推测两者属于膜外蛋白。

图1 PpCAL1和PpCAL2的结构功能域和跨膜结构域

3.4 PpCAL1 和PpCAL2 蛋白的二级结构与三级结构预测

预测PpCAL1和PpCAL2蛋白的二级结构（图2A、图2B）。结果显示，PpCAL1 蛋白由α-螺旋（143 个氨基酸，66.82%）、无规卷曲（48 个氨基酸，22.43%）、延伸链（23 个氨基酸，10.75%）组成。PpCAL2 蛋白由α-螺旋（125 个氨基酸，51.02%）、无规卷曲（88 个氨基酸，35.92%）、延伸链（32 个氨基酸，13.06%）组成。2 个蛋白氨基酸数量均呈现α-螺旋>无规则卷曲>延伸链的规律。对蛋白进行同源建模并构建三维空间模型（图2C、图2D）。

图2 PpCAL1和PpCAL2的二级结构和三级结构预测

3.5 同源氨基酸序列比对

将PpCAL1和PpCAL2蛋白的氨基酸序列与其他物种氨基酸序列进行同源比对（图3）。白花前胡PpCAL1 序列与胡萝卜DcCAL 和茶树CsCAL 同源性分别为60.27%、44.81%；白花前胡PpCAL2序列与蓖麻RcCAL 和橡胶树HbCAL 同源性分别为72.36%、71.72%。

图3 PpCAL1和PpCAL2与其他物种的氨基酸同源性比对

3.6 PpCAL1和PpCAL2蛋白系统进化树分析

利用NCBI 下载其他物种CAL 编码蛋白的氨基酸序列，用MEGA 6.0 软件采用邻接法对包含白花前胡PpCAL1 和PpCAL2 在内的CAL 氨基酸序列构建系统进化树（图4）。结果显示，白花前胡PpCAL1 与伞形科的胡萝卜DcCAL 序列位于同一分支，表明二者具有较近的亲缘关系，白花前胡PpCAL2 与大戟科的橡胶树HbCAL 序列位于同一分支，表明二者具有较近的亲缘关系。

3.7 原核表达分析

将未经IPTG 诱导与IPTG 诱导后的菌液进行SDS-PAGE 电泳验证。结果显示，与空载相比，pET-32a-PpCAL1 诱导后的全菌在约40 000 处出现明显的目的蛋白条带，pET-32a-PpCAL2 诱导后的全菌在约43 000 处出现明显的目的蛋白条带，符合预期蛋白相对分子质量大小（图5）。

图5 PpCAL1和PpCAL2重组蛋白原核表达

3.8 雌前胡和雄前胡不同器官开花基因表达分析

分析白花前胡PpCAL1和PpCAL2基因在抽薹开花前后叶和根中的表达模式（图6）。结果显示，在叶、根不同组织中PpCAL1和PpCAL2基因均有表达，在抽薹后前胡的叶和根中PpCAL1和PpCAL2均出现明显的上调表达。

图6 PpCAL1和PpCAL2基因在白花前胡抽薹开花前后叶和根中的表达水平（,n=3）

4 讨论

植物发育过程可以看作其茎端分生组织经历了相互衔接的3 个发育阶段，即营养分生组织、花序分生组织、花分生组织，在这3 个阶段中有多种基因产物参与调节，其中决定花分生组织属性的基因有CAL、AP1、AP2等[14]。AP1和CAL互为旁系同源基因，AP1和CAL的表达情况决定花分生组织的分化[8]。在模式植物拟南芥中，AP1和CAL是进化过程中基因复制事件产生的同源序列，其编码MADS 结构域可能作为转录因子发挥作用[19]。

MADS-box基因在被子植物叶、根中广泛表达[8]，不同水平的基因表达在不同程度上影响植物的生长发育。有研究表明，在欧洲白桦中过量表达BpAP1基因可引起白桦提早开花[20]。宋拉拉等[21]在大豆中克隆出AP1的同源基因GmAP1，在拟南芥中过表达GmAP1后植株出现早花现象。说明AP1基因可能具有促进植物开花的功能。CAL基因在早期花原基中有表达，但在花萼与花瓣原基中的表达很弱[19]。有学者通过构建BoCAL和BobCAL植物双元表达载体，得到转基因拟南芥，得出BoCAL和BobCAL具有促进拟南芥Col 生态型植物提前开花的功能的结论，说明了芸薹属中CAL同源基因与拟南芥中的AP1、CAL具有相似的功能，是开花启动子之一[16]。有研究在烟草中过量表达麻疯树CAL同源基因JcCALA-Like，可使烟草提前开花[22]。可见该家族基因对调控植物开花时间的重要作用。本研究从白花前胡转录组中获得了2 条开花基因PpCAL1和PpCAL2并对其进行不同生长时期的基因表达量分析，结果表明，在白花前胡的叶和根中，PpCAL1和PpCAL2基因的相对表达量均在抽薹开花后出现上调，初步推测CAL基因可能在白花前胡的抽薹开花过程中发挥了作用。

白花前胡PpCAL1和PpCAL2基因分别编码214、245 个氨基酸。生物信息学分析预测PpCAL1 和PpCAL2 不具有跨膜结构，为膜外蛋白。系统发育树结果表明，白花前胡PpCAL1 与胡萝卜DcCAL 序列位于同一分支，白花前胡PpCAL2 与橡胶树HbCAL 序列位于同一分支，由此可以推测PpCAL1蛋白与胡萝卜DcCAL 蛋白的功能较相近，PpCAL2蛋白与橡胶树HbCAL蛋白的功能较相近。

白花前胡早薹使根部组织结构发生变化，根部逐渐纤维化，造成活性成分香豆素类成分含量变化，影响药材品质[23]。而白花前胡的抽薹开花分子机制目前尚不明确，有关白花前胡开花基因CAL的研究尚未见报道。本研究从白花前胡中克隆PpCAL1和PpCAL2基因并进行生物信息学分析，构建了重组表达载体进行原核表达分析，对2 个基因在不同发育期根、叶中的表达水平进行分析，弥补了伞形科药用植物白花前胡CAL基因相关研究的空缺，为在分子水平上进一步研究药用植物抽薹开花机制提供了重要信息，也为白花前胡基因克隆、功能验证等相关基因分子作用机制研究提供了参考。