外源性直流电场诱导大鼠扩张皮肤软组织血管新生的作用研究

刘 天,张警泓,刘 杰,张 泽,武 潮,张家平

（1.陆军军医大学第一附属医院整形外科，重庆 400038；2.重庆医科大学附属第二医院整形美容与颌面外科，重庆 400010）

扩张皮瓣移植是整形外科用于治疗大面积瘢痕与瘢痕挛缩畸形等皮肤软组织继发病损的重要技术[1]。通过皮肤软组织扩张可以获得更大面积、更小厚度的供体皮瓣，从而获得更好的修复质量和效果[2]。血管危象是扩张皮瓣移植最为常见的并发症，直接影响手术成败，其发生的主要原因之一是皮瓣内血管网的丰度不足以维持所切取皮瓣的正常血供及代谢[3]。血管新生是在原有血管结构上长出新血管的生物学过程[4]。诱导扩张皮瓣内微小血管新生是增强扩张皮瓣血供的可行策略，也是本领域的难点[5]。近年来，采用外源性电场促进血管新生的研究在细胞层面已取得一定进展[6-9]，但相关的体内研究未见报道。本课题以SD大鼠为实验对象，探讨外源性直流电场对扩张皮肤软组织血管新生的作用并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级4～6周龄雄性SD 大鼠24只（体质量200～220 g），购自陆军军医大学实验动物中心，动物生产许可证号：SYXK（渝）2022-0018，饲养于恒温恒湿、昼夜规律标准化饲养间。动物手术操作环境及流程严格遵照陆军军医大学实验动物中心的标准进行。

1.2 主要实验试剂及设备

异氟烷（深圳瑞沃德生命科技，R510-22-10），小动物麻醉机（深圳瑞沃德生命科技，R500-IP），1 mL 球形硅胶皮肤扩张器（广州万和整形材料），电极片（深圳创兴禾科技，PMD1×1a），稳压直流电源（东莞优利德科技，UTP1310S），光学显微镜（日本尼康，E200），荧光显微镜（德国蔡司，Axio Imager M2），酶标仪（美国BIORAD，iMark-17562），离心机（美国Thermo赛默飞世尔，Micro 21R）。

1.3 动物模型构建

1.3.1 动物分组 采用随机数字表法将SD大鼠随机分为直流电场刺激组（实验组）和对照组，实验组大鼠又根据所施加电场强度不同分为100 mV/mm 电场组、200 mV/mm电场组和300 mV/mm电场组，每组6只。

1.3.2 动物模型构建 实验动物施以异氟烷麻醉，待麻醉稳定后用剃毛机及脱毛膏严格术区脱毛处理，俯卧位固定。采用1 mL微型扩张器（图1a）在体外注水30 mL，进行超量扩张检查，挑选形态完好、扩张均匀的扩张器用于后续实验。常规消毒铺单后，于大鼠颈背部设计一横向手术切口，长约1.5 cm。美兰标记切口，切开皮肤全层，眼科剪钝性分离皮下组织至深筋膜层，在深筋膜层钝性分离形成皮下腔隙，腔隙前至外眦连线，后至耳前连线，两侧至颧骨边界。将1 mL微型扩张器置入所分离皮下腔隙，扩张器注射壶埋置于大鼠背部，调整扩张器位置，使其位于颅顶部中央。采用5-0 丝线全层缝合手术切口，术毕向扩张器内注入1 mL 无菌生理盐水（图1b）。术后第7 天开始，每隔3 d 在气体麻醉下通过注射壶向扩张器中注入1 mL 无菌生理盐水（图1c）。第3 次注水后(术后第13 天)，将直径为10 mm 的正/负凝胶电极分别固定于实验组大鼠扩张头皮的头、尾两端，外接稳压直流电源，分别施加100 mV/mm、200 mV/mm 和300 mV/mm 的直流电场刺激，持续72 h（图1d～f）。电场刺激结束后，继续每3 d向扩张器中注入1 mL无菌生理盐水，共注水4次。对照组除不进行电极刺激外，余处理同实验组。

图1 大鼠头部扩张皮肤处构建外源性稳压直流电场模型

1.4 明暗箱实验

将大鼠置于明箱中央，背对洞口，记录10 min 内动物的穿箱次数以及分别在明箱和暗箱的滞留时间。

1.5 动物处理与取材

注水扩张7 次后处死大鼠，用无菌手术刀切取凝胶电极片间的大鼠扩张头皮组织，部分采用4%多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片和HE 染色；部分组织匀浆行ELISA检测。

1.6 样品检测

1.6.1 切片染色 按常规方法行HE 染色和Masson染色后，随机选取5个高倍视野，统计视野内的血管数量。免疫荧光染色：切片经0.01 mol/L PBS 充分洗涤后置于3% H2O2去离子水中孵育10 min，以阻断内源性过氧化酶；加入FGF-2 一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜，之后加入对应荧光二抗室温孵育1 h，采用DAPI染细胞核10 min 后封片，于荧光显微镜下观察、拍照。参照文献[10]中的方法行免疫组化染色，一抗为Ki67（1∶200），DAB显色后光学显微镜下观察。

1.6.2 ELISA 检测 采用预冷的PBS(0.01 mol/L,pH=7.4)冲洗大鼠头皮组织，称重后将组织剪碎，与9 倍质量的PBS 加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。将匀浆液5 000 g 离心5 min，取上清，根据大鼠基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1，SDF-1)、大鼠血管内皮生长因子α(vascular endothelial growth factor α，VEGF-α)ELISA 试剂盒进行检测，于450 nm 波长下计算SDF-1和VEGF-α含量。

1.7 统计学分析

使用SPSS 23.0 软件分析数据，所有数据均采用Shapiro-Wilk法行正态性检验及Levene法行方差齐性检验，定量数据以均数±标准差（）表示。2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物基本情况

所有动物均麻醉满意且耐受建模手术，术后无伤口感染、球囊破损等异常情况，扩张器扩张状态良好，无漏水、破裂、移位等。施加100 mV/mm和200 mV/mm外源性直流电场的SD 大鼠均表现出良好的耐受性。其中4 只施加300 mV/mm 电场的SD 大鼠出现不同程度的间断性抽搐、焦虑、烦躁等不适合继续实验的症状，因而该组的后续实验予以终止。10 min 标准明暗箱实验结果显示，100 mV/mm 组和200 mV/mm 电场组大鼠的穿箱次数分别为（9.00±1.83）次和（9.83±1.57）次，提示2 组大鼠均无明显焦虑症状，对所施加的外源性电场耐受良好。

2.2 HE和Masson染色

HE 染色：对照组大鼠头皮组织表皮层由2～3层角质细胞组成，平均厚度为（24.2±3.2）μm；实验组大鼠头皮组织表皮层细胞数增多，100 mV/mm 组的平均厚度为（42.0±4.7）μm，200 mV/mm 组的平均厚度为（62.6±4.4）μm，均厚于对照组（P＜0.01），表皮厚度随施加电场强度增强而呈增大趋势（P＜0.01），见图2a、b。实验组真皮层和真皮下层的微小血管数较对照组明显增加（P＜0.05），其中真皮下层的微小血管增多更明显；大鼠皮下脂肪与肌肉组织厚度较对照组明显薄，胶原纤维排列整齐，毛囊及汗腺等皮肤附属器官结构完整（图2a～d）。Masson 染色：与对照组比较，实验组的疏松皮下胶原纤维组织减少（图2e）。

图2 外源性稳压直流电场施加后大鼠扩张头皮的组织病理学检测

2.3 组织学免疫染色

与对照组比较，100 mV/mm 电场组和200 mV/mm电场组Ki67 染色强度明显升高，量化评分显著升高（P＜0.05），见图3a、b。进一步观察发现，实验组增多的Ki67 阳性细胞主要来源于表皮基底层矮柱状上皮细胞、新生血管内皮细胞以及毛囊细胞。

图3 各组大鼠头皮组织免疫染色结果

与对照组比较，100 mV/mm 电场组和200 mV/mm电场组FGF-2 的表达增加，FGF-2 阳性细胞比例均显著增高（P＜0.05），见图3c、d。

2.4 ELISA检测

组织匀浆ELISA 检测结果显示：100 mV/mm 电场组和200 mV/mm 电场组的SDF-1、VEGF-α的表达量均较对照组显著升高（P＜0.05），且200 mV/mm 电场组VEGF-α 表达高于100 mV/mm 电场组（P＜0.05），见图4。

图4 ELISA检测各组大鼠头皮组织血管新生相关因子表达

3 讨论

血管危象或血运障碍是扩张皮瓣移植术后常见的并发症，直接关乎手术成败和临床预后。除外皮瓣设计不合理、皮瓣转移后蒂部扭转或卡顿等常见原因外，扩张皮瓣本身的新生血管丰度不足也是导致扩张皮瓣移植术后血运障碍、皮瓣继发坏死的重要原因，同时也是影响扩张皮瓣扩张效率的重要制约因素[3]。

1794 年，Luigi Galvani 首次证实“生物电”存在。1848 年，德国生理学家Emil du Bois-Reymond 首次描述了皮肤伤口内的电流[11]。随后的研究发现，细胞的许多生物学效应均与生物电场直接相关，且生物电场是影响组织再生和伤口愈合的重要因素[12-13]。体外研究发现，与生物电场强度相当的外源性电场可以有效诱导表皮细胞定向迁移、诱导血管内皮细胞增殖并形成新生血管[9,14]。然而，有关生物电场诱导血管新生的体内研究目前尚处于起步阶段。本研究旨在通过建立大鼠扩张头皮外源性直流电场刺激模型，探索外源性直流电场对扩张皮肤及血管新生的影响与机制。

本研究结果显示，在4～6 周龄的大鼠头皮组织下埋置1 mL 的微型扩张器，注水扩张7 次后，皮肤扩张显著；观察大鼠日常活动发现，扩张器扩张过程对大鼠日常活动无明显不良影响。本研究根据头皮组织扩张后的形态体积，定制直径为10 mm的凝胶电极片，将正、负电极分别粘贴固定于扩张头皮组织的头、尾两端，外接稳压直流电源，建立SD 大鼠扩张头皮软组织外源性电场刺激模型。前期我们在电场刺激干预对巴马香猪的创面愈合影响实验中设置了100 mV/mm、200 mV/mm 和300 mV/mm 三个梯度强度的电场刺激[6]。本研究中由于300 mV/mm 电场组超半数的大鼠出现抽搐、焦虑和烦躁等刺激症状，因此后续实验中仅观察100 mV/mm 和200 mV/mm 电场扩张皮肤软组织的相关变化。

以往研究发现，在皮肤软组织扩张过程中，机械力学刺激将显著诱导组织大量分泌VEGF 和诱导血管新生，但随着扩张过程持续，VEGF 分泌和血管新生于扩张后2 周降至正常水平[15-16]。我们也在实验中观察到了同样的现象。为避免扩张过程机械力学因素对血管新生的干扰，我们将外源性电场的刺激时机选定为第3 次注水扩张后（术后第13 天），以客观评估外源性直流电场对扩张皮肤软组织血管新生的作用，因此外源性直流电场的施加时机是本模型成功建立的另一关键。

Ki67 是细胞增殖标志物，与细胞有丝分裂密切相关[17]。FGF-2 具有促血管生成作用，常被用作血管生成的指标之一[18]。SDF-1 和VEGF-α 是两种与血管生成密切相关的细胞因子。其中，SDF-1 具有诱导VEGF-α 表达的重要作用，而VEGF-α 则可激活SDF-1/CXCR4 信号轴，二者在促血管生成方面具有协同效果[19-20]。本研究发现，100 mV/mm 和200 mV/mm 电场组大鼠真皮内和真皮下微小血管数增加、血管内皮细胞增殖活跃，FGF-2 和VEGF-α 的表达增加，且这一作用在一定电场强度范围内与电场强度呈正相关，说明外源性直流电场可以显著诱导大鼠扩张皮肤软组织的血管新生。FGF-2是成纤维细胞生长因子家族的核心成员，在促进内皮细胞增殖并形成管腔结构等血管化核心环节中发挥重要作用[18-19,21]。FGF-2 和VEGF-α具有协同互补的作用。有研究显示，VEGF-α 可促进毛细血管的生成，而FGF-2 则可促进小动脉的生成[22]。研究报道，FGF-2 通过ERK 1/2 途径促进血管内皮细胞增生，而VEGF-α 需在外围间质细胞的旁分泌功能辅助下发挥促血管生成作用，同时二者共同调节MAPK 通路的活性[19]。本研究发现，血管新生程度高的皮肤软组织往往伴随表皮层明显增厚，而表皮细胞又是FGF-2的重要来源细胞。因此，我们推测，电场可能通过刺激表皮细胞增殖而促进FGF-2 的分泌，从而诱导血管新生，但具体机制以及血管新生和角质细胞增殖的关系需要进一步研究。

综上所述，本研究成功建立了外源性直流电场诱导扩张皮肤软组织血管新生的动物模型，明确了外源性直流电场对扩张皮肤软组织血管新生的促进作用，并初步探讨其机制，为采用直流电场诱导皮肤软组织血管新生，增加扩张皮瓣的切取面积，降低扩张皮瓣的血管危象发生率和提高扩张皮瓣移植存活率提供了实验依据。