AM真菌孢子保藏条件的研究—以异形根孢囊霉为例

黎 雪,胡文涛,况宇瑄,唐 明

(岭南现代农业科学与技术广东省实验室/华南农业大学 林学与风景园林学院,广东 广州 510640)

丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌能够与72%以上的维管植物共生,形成丛枝菌根[1],包括大多数林木[2-3]。菌根的形成能够促进林木生长,提高光合能力[4],增强植物对干旱[5]、盐碱[6]以及重金属的耐受性[7]。基于AM真菌与植物生态系统的良好互作潜力,作为生物肥料可应用于土壤改良和生态系统恢复,其菌种新型保藏技术的开发对于AM真菌应用于发展绿色农业具有一定意义[8]。新鲜的AM真菌孢子中存在大量的休眠孢子[9],孢子的休眠时间可能因营养、生物和环境因素的不同持续数周甚至数月[10]。大多数AM真菌孢子都有后熟过程[11],低温处理能促进后熟过程,提高孢子成熟程度,从而提高孢子的萌发率[12]。

传统的AM真菌菌种保藏方法有活体寄主体内繁殖保藏、根器官体外培养保藏2种[13]。体外保藏是将混有AM真菌孢子的土壤干燥后于-60～-70 ℃冷冻保存,3个月后AM真菌孢子发芽率与初始几乎无变化[14],而将含有AM真菌繁殖体的土壤冷冻干燥后储藏8 a,其存活率从90%～100%下降到0%～30%[15]。张淑彬等[16]将摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)的菌种培养物(含孢子的河沙沸石混合物)装入离心管中,于18～20、4、-20、-80 ℃ 4种温度下保藏,发现1～2 a内孢子活力下降至原来的20%以下;超过2 a孢子生理状态急剧降低、失去侵染能力。

AM真菌保藏方法大多为菌种混合物的保藏,鲜有关于AM真菌纯孢子保藏试验的探究。为探寻更简单有效、操作性强、花费更少的高品质AM真菌菌剂保藏方法,本研究在4 ℃和-20 ℃温度下采用纯水和甘油作为保藏介质,添加植物组培抗菌剂(plant preservation mixture,PPM),测定保藏2个月和5个月后的孢子侵染活性,从而确定Ri纯孢子保藏的最佳条件,为AM真菌纯孢子的短期、中期保藏提供一定参考依据,对AM真菌研究和应用的菌种纯孢子的储存具有实际意义。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

AM真菌异形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis,Ri,DAOM197198)购于北京市农林科学研究院植物营养研究所,经玉米(Zeamays)扩繁后,采用湿筛倾析法分离得到AM真菌孢子[17]。孢子过0.45 μm滤布去除杂质后,于无菌水中保存,得到初始新鲜孢子液。

1.2 培养基质

河沙(粒径<1 mm)和蛭石(粒径<3 mm)按1∶1体积混合,高压蒸汽(121 ℃、0.1 MPa)灭菌2 h,冷却、备用。

1.3 供试植物

三叶草(Trifoliumrepens)和玉米种子经1.5%次氯酸钠消毒15 min,无菌水冲洗3次后,浸泡催芽并播种到培养基质中。每天浇水保持湿润,1周左右选择长势一致的玉米和三叶草分别移栽到装有2 kg培养基质的塑料盆中。盆大小为10 cm×10 cm×8 cm,玉米每盆种植1株,三叶草每盆种植3～5株。

1.4 试验设计

共设置4个因素:1)保藏时间(2个月,5个月);2)保藏介质(甘油,纯水);3)保藏温度(4 ℃,-20 ℃);4)保藏介质中添加或不添加植物组培抗菌剂(PPM)。每个处理5个重复。甘油、纯水于灭菌锅中121 ℃、0.1 MPa灭菌15 min,PPM过滤灭菌。初始孢子液(0.5 mL,约有150个孢子)和保藏介质(1.5 mL)加入2 mL无菌离心管中混匀后置于4 ℃和-20 ℃保藏。每种条件下保藏10管,共80管。

传统的甘油保藏法保藏菌种在-70 ℃可以保藏3～5 a,在-20 ℃保藏时间更短,约1 a。因此本研究以1 a作为保藏的最终期限,2个月为短期,5个月为中期,12个月为长期。

1.5 孢子侵染活性测定

首先,将0.5 mL初始孢子悬浮液接种到玉米和三叶草的根际,各接种5盆(作为原始孢子侵染活性的参照);然后,2个月和5个月后将不同保藏条件下的孢子液接种到玉米和三叶草根际;45 d后收获植物根系,采用[18]改进的台盼蓝染色法染色,使用网格线交叉法[19]测定根系侵染率,采用Hu等[20]开发的VBA-AMF软件统计原始数据。玉米和三叶草培育期间,每周浇2次原浓度50% Hoagland低P(30 μmol·L-1)溶液(50 mL·盆-1),培养温度25 ℃,湿度60%～85%,白炽灯光照2 000 lx,光周期为16 h。

1.6 数据分析

使用Excel 2019数据统计分析软件对原始数据进行整理。使用SPSS 22.0(Armonk,USA)进行数据的方差分析,所有数据采用HSD法在显著水平为5%条件下进行比较,当P<0.05时,差异显著。采用GraphPad Prism9.0制图(GraphPad,USA)。

2 结果与分析

2.1 保藏条件对Ri孢子侵染玉米的影响

2.1.1 短期保藏Ri孢子对侵染玉米的影响 保藏温度相同时,Ri孢子在甘油和纯水中的活性无显著差异。保藏介质相同时,Ri孢子在4 ℃和-20 ℃下活性无显著差异。保藏温度为4 ℃时,Ri孢子在甘油和纯水介质保藏2个月对玉米根系侵染率分别为26.33%和26.91%(图1A);保藏温度为-20 ℃时,Ri孢子在甘油和纯水介质保藏2个月对玉米根系侵染率分别为21.91%和25.20%(图1B)。

CK.原始孢子液;G.甘油;PW.纯水;PPM.植物组培抗菌剂。应用HSD法检验各处理间差异显著性,柱子上不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同。图1 异形根孢囊霉孢子保藏2个月后玉米侵染率Fig.1 Clononization of Zea mays roots of R.irregularis spores at different temperatures for 2 months

PPM的添加能够提高甘油和纯水中保藏的Ri孢子活性,使甘油中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃时对玉米根系侵染率分别提高8.71%和12.81%;使纯水中保藏的Ri孢子在-20 ℃时对玉米根系侵染率提高8.24%(图1B)。

2.1.2 中期保藏Ri孢子对侵染玉米的影响 保藏温度相同时,Ri孢子在甘油中的活性显著低于在纯水中的活性(F4 ℃=118.461,P=0.000;F-20 ℃=500.581,P=0.000)。保藏介质为甘油时,Ri孢子活性不受保藏温度影响;保藏介质为纯水时,Ri孢子在4 ℃下活性显著高于-20 ℃下活性(F=57.733,P=0.002)。保藏温度为4 ℃时,Ri孢子在甘油和纯水介质中保藏5个月对玉米根系侵染率分别为3.55%和52.92%(图2A);保藏温度为-20 ℃时,Ri孢子在甘油和纯水介质中保藏5个月对玉米根系侵染率分别为3.56%和18.40%(图2B)。

图2 异形根孢囊霉孢子保藏5个月后玉米侵染率Fig.2 Clononization of Z.mays roots of R.irregularis spores at different temperatures for 5 months

PPM的添加能够提高甘油中保藏的Ri孢子活性,而降低纯水中保藏的Ri孢子活性,使甘油中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃时对玉米根系侵染率分别提高13.46%和5.71%;使纯水中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃时对玉米根系侵染率分别降低50.4%和1.52%。

不同保藏条件下的Ri孢子对玉米根系的侵染情况见图3。

a～d.初始Ri孢子侵染玉米根系图;e～h.分别为4 ℃条件下甘油、甘油+PPM、纯水、纯水+PPM保藏2个月后Ri孢子侵染玉米根系图;i～l.分别为-20 ℃条件下甘油、甘油+PPM、纯水、纯水+PMM保藏2个月后Ri孢子侵染玉米根系图;m～p.分别为4 ℃条件下甘油、甘油+PPM、纯水、纯水+PPM保藏5个月后Ri孢子侵染玉米根系图;q～t.别为-20 ℃条件下甘油、甘油+PPM、纯水、纯水+PPM保藏5个月后Ri孢子侵染玉米根系图;H.菌丝;V.泡囊;A.丛枝。图中q标尺为200 μm,其余标尺为500 μm。图3 不同保藏条件下玉米根系侵染Fig.3 Picture of colonization for Zea mays roots at different preservation conditions

2.2 保藏条件对Ri孢子侵染三叶草的影响

2.2.1 短期保藏Ri孢子对侵染三叶草的影响 保藏温度相同时,Ri孢子在甘油和纯水中的活性无显著差异。保藏介质相同时,Ri孢子在4 ℃和-20 ℃下活性无显著差异。保藏温度为4 ℃时,Ri孢子在甘油和纯水介质保藏2个月对三叶草根系的侵染率分别为21%和19.20%(图4A);保藏温度为-20 ℃时,Ri孢子在甘油和纯水介质保藏2个月对三叶草根系的侵染率分别为21.44%和19.57%(图4B)。

图4 异形根孢囊霉孢子保藏2个月后三叶草侵染率Fig.4 Clononization of Trifolium repens roots of R.irregularis spores at different temperatures for 2 months

PPM的添加能够提高甘油和纯水中保藏的Ri孢子活性,使甘油中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃时对三叶草根系侵染率分别提高15.75%和27.99%;使纯水中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃时对三叶草根系侵染率分别提高12.77%和16.77%。

2.2.2 中期保藏Ri孢子对侵染三叶草的影响 保藏温度相同时,Ri孢子在甘油中的活性低于在纯水中的活性(F4 ℃=410.019,P=0.000;F-20 ℃=1.047,P=0.364)。保藏介质为甘油时,Ri孢子活性不受保藏温度影响;保藏介质为纯水时,Ri孢子在4 ℃下活性显著高于-20 ℃下的活性(F=98.052,P=0.001)。保藏温度为4 ℃时,Ri孢子在甘油和纯水介质保藏5个月对三叶草根系侵染率分别为12.59%和71.76%(图5A);保藏温度为-20 ℃时,Ri孢子在甘油和纯水介质保藏5个后对三叶草根系侵染率分别为12.51%和18.19%(图5B)。

图5 异形根孢囊霉孢子保藏5个月后三叶草侵染率Fig.5 Clononization of T.repens roots of R.irregularis spores at different temperatures for 5 months

PPM的添加能够提高甘油中保藏的Ri孢子活性,而降低纯水中保藏的Ri孢子活性,使甘油中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃时对三叶草根系侵染率分别提高10.55%和2.24%;使纯水中保藏的Ri孢子在4 ℃和-20 ℃时对三叶草根系侵染率分别降低58.45%和5.11%。

不同保藏条件下的Ri孢子对三叶草根系的侵染情况见图6。

a～d.初始Ri孢子侵染三叶草根系图;e～h.分别为4 ℃条件下甘油、甘油+PPM、纯水、纯水+PPM保藏2个月后Ri孢子侵染三叶草根系图;i～l.分别为-20 ℃条件下甘油、甘油+PPM、纯水、纯水+PMM保藏2个月后Ri孢子侵染三叶草根系图;m～p.分别为4 ℃条件下甘油、甘油+PPM、纯水、纯水+PPM保藏5个月后Ri孢子侵染三叶草根系图;q～t.分别为-20 ℃条件下甘油、甘油+PPM、纯水、纯水+PPM保藏5个月后Ri孢子侵染三叶草根系图;H.菌丝;V.泡囊;A.丛枝。图中C标尺为100 μm,其余标尺长度为500 μm。图6 不同保藏条件下三叶草根系侵染Fig.6 Picture of colonization for Trifolium repens roots at different preservation conditions

3 结论与讨论

3.1 结论

研究结果表明,短期保藏Ri孢子时,在纯水和甘油2种介质以及在4 ℃和-20 ℃中的孢子活性无显著差异;添加PPM能够提高孢子在纯水和甘油中的活性。中期保藏Ri孢子时,纯水保藏活性高于甘油;4 ℃低温保藏显著提高孢子侵染活性;添加PPM能够提高孢子在甘油中保藏的活性,而降低在纯水中保藏的活性。因此,对异形根孢囊霉短期保藏(2个月)选择纯水+PPM作为保藏介质于4 ℃保藏;中期保藏(5个月)选择纯水作为保藏介质于4 ℃保藏。

3.2 讨论

3.2.1 Ri孢子对不同宿主的侵染情况 AM真菌对宿主植物的亲和性会因不同宿主而异[21],三叶草和玉米根系接种AM真菌后,三叶草根系侵染率高于玉米根系侵染率[22-23]。AM真菌孢子侵染宿主时会受到温度、光照、湿度[23]以及土壤营养状况[24]]等因素的影响。本研究除宿主种类不同外,土壤、真菌、生长环境条件均保持一致,初始新鲜Ri孢子对三叶草根系的侵染率为66.68%,显著高于玉米根系侵染率41.85%(F=22.360,P=0.009),这说明宿主是影响侵染率的关键因素。Ri对三叶草的亲和性高于玉米,可能与两者的根系分泌物[25,26]和须根丰富度有关[23]。

3.2.2 保藏时间、温度和介质对Ri孢子侵染活力的影响 长时间干燥泥沙介质保藏孢子会导致大多数孢子干燥失水,难以维持正常生理状态,最终失去侵染能力,由此可见孢子内部充足的水分是维持其正常生理状态的必要条件[16]。本研究选择30%甘油及纯水作为保藏介质,能够保证孢子长时间保藏后不会因干燥失水而失去侵染能力。

甘油作为一种冷冻保护剂,与水结合减少冰晶的形成和降低细胞内外未结冰溶液电解质的浓度,可使细胞免受溶质的损伤[27],广泛用于真菌保藏[28]。纯水在-20 ℃会结冰从而对其中保藏的孢子造成不利影响[29],理论上,纯水中保藏的孢子活性应该低于甘油中保藏孢子活性,而本研究结果是2种介质中孢子活性无差异,这可能与Ri孢子本身作为厚垣孢子含有丰富的脂质有关[30],能够有效帮助孢子抵御-80 ℃低温胁迫[31]。因此,2个月时在-20 ℃、纯水保藏的Ri孢子不会受到冻害,从而保持与4 ℃低温下保藏的Ri孢子活性同步。

Ri孢子保藏5个月时,在纯水中保藏活性高于在甘油中的保藏活性。离体下的AM真菌孢子萌发会受到pH、温度、湿度、储存时间及抑制物质的影响[25],甘油本身存在一定的渗透压,会影响水、营养物等进入休眠孢子,不利于休眠孢子萌发;而纯水不存在影响孢子萌发的渗透压,休眠孢子在适宜条件下打破休眠即可正常萌发,因而纯水中保藏的孢子活性高于甘油中。另外,Ri孢子可能存在后熟作用,纯水中低温保藏5个月,一部分Ri孢子完成后熟过程,从而提高Ri孢子的侵染活性[12]。

本研究发现,Ri孢子在4 ℃、纯水介质保藏5个月会显著提高侵染活性,是因为在4 ℃低温长期保藏后大量休眠孢子打破休眠发挥其侵染作用,另外也可能与Ri孢子完成后熟过程有关[12]。新鲜孢子发芽缓慢,将其于6 ℃下贮藏数周会大大提高孢子萌发率[32],董昌金等[25]将富含AM真菌孢子的土壤放在4 ℃冰箱1～2个月,孢子萌发率提高28%～50%,且低温贮藏时间越久,孢子萌发率越高。邵菊芳等[33]对球状巨孢囊霉(Gigasporamargarita)、摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)的孢子在4 ℃下贮藏10～50 d,显著提高了孢子萌发率,说明低温处理和长期储藏是打破休眠的关键步骤。

3.2.3 PPM的添加对Ri孢子侵染活力的影响 本研究发现,PPM的添加在2个月内能够一定程度维持甘油和纯水中保藏的孢子活性,在2～5个月能够一定程度上维持甘油中保藏的孢子活性,而降低纯水中保藏的孢子活性。PPM能够维持孢子活性是由于其具有抗菌的特点,PPM能够破坏细菌细胞壁主要成分肽聚糖,而对AM真菌细胞壁几丁质没有作用,且AM真菌为厚垣孢子,PPM很难穿过其进入孢子内部对其造成不利影响[31]。Ri孢子在含有PPM的纯水保藏5个月活性反而降低,造成该现象的原因可能是孢子外源性休眠[34]。经过5个月保藏后,具有抗菌作用的PPM成为休眠孢子萌发环境中的一种抑制剂,一部分休眠孢子感知到对自身有害的抗菌剂存在迫其延迟萌发[35]。