一株鸡源血清4 型禽腺病毒的分离鉴定及动物回归试验

吴 植，黄 佳，吴 双，谢 军，顾陈怡，徐 艳，张 聪，袁慧莎

（江苏农牧科技职业学院 江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏现代畜牧与新兽药工程技术中心，江苏 泰州 225300）

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)归属于腺病毒科禽腺病毒属，因为群特异性抗原不同分为三群。我国流行的禽腺病毒以I 群禽腺病毒（Fowl aviadenovirusgroupⅠ,FAdV-Ⅰ）为主，发病率逐年增加。Ⅰ群禽腺病毒有12 个血清型(FAdV 1-12)，近几年我国主要流行的禽腺病毒血清型为FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b 和FAdV-11 型，其中由血清4型I 群禽腺病毒（FAdV-4）引起的鸡心包积水- 肝炎综合征(IBH-HPS)对家禽养殖危害最大。由于不同血清型的混合感染以及与其他病毒形成混合感染和继发感染，其复杂性对疫苗的研制以及对防控FAdV-4 产生较大困难，给国内养鸡行业带来严重的经济损失。本研究对广西送检疑似感染4 型禽腺病毒病死鸡组织通过病毒分离，PCR 扩增与序列测定，确定分离出一株血清4 型禽腺病毒并进行了动物回归试验，为临床开展该病的综合防控提供了一定的技术指导。

1 材料和方法

1.1 病料来源及试验动物2021 年广西送检一份疑似血清4 型禽腺病毒感染的患病鸡；SPF 种鸡蛋购自山东昊泰实验动物繁育有限公司，由本实验室自行孵化至7 日龄或出雏，雏鸡转移隔离器中饲养。

1.2 主要试剂Viral RNA/DNA Kit DNA/RNA提取试剂盒购自CWBIO，2×Taq Master Mix、Fast-Pure Gel DNA Extraction Mini Kit 凝胶回收试剂盒、FastPure plasmid Mini Kit 质粒提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，DNA marker 购自Solarbio，VETEC 琼脂粉购自上海百研生物科技有限公司，克隆载体T-easy 购自Promega 公司，E.coli DH5α 购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 病毒分离无菌采取0.3 g 病死鸡肝脏，放入装有碾磨珠和900 μLPBS 缓冲液的灭菌碾磨管中，经FastPrep-24TM5G 高速匀浆仪研磨1 min，反复冻融3 次，5000 rpm，离心10 min，取组织研磨上清液用0.22 μm 无菌滤器过滤除菌，采用卵黄囊接种方法接种7 日龄SPF 鸡胚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，照蛋2 次/d，剔除24 h 内死亡鸡胚，继续孵化至5 d，将未死亡鸡胚在4 ℃条件下放置4 h 以上，收集鸡胚的尿囊液用0.22 μm 无菌滤器过滤再次接种7 日龄SPF 鸡胚，连续盲传3 代，收集尿囊液离心取上清液通过PCR 方法进行病毒鉴定。

1.4 血凝实验取50 μL 尿囊液于96 孔血凝板中，依次用生理盐水进行倍比稀释至11 孔，弃去液体，第12 孔加50 μL 生理盐水做阴性对照，每孔加入50 μL 的1%新鲜制备的鸡红细胞，37℃反应30 min 后观察结果，观察尿囊液是否具有凝集红细胞的能力。

1.5 PCR 鉴定与序列测定根据GenBbank 发表的Hexon 保守序列设计引物，FAdV-F：CAACTACATCGGGTTCAGGGATAACTTC，FAdV-2：CCAGTT TCTGTGGTGGTTGAAGGGGTT，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。参照DNA/RNA 提取试剂盒说明书进行尿囊液病毒基因组提取，取2 μL病毒DNA 为模板进行PCR 扩增。反应体系为25 μL：2×Taq Master Mix12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL(20μmoL/L）、病毒基因组2 μL、灭菌水8.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR 产物于100 V电压下经1.5%琼脂糖凝胶进行核酸电泳，观察目的片段大小。将纯化的目的片段克隆至pGEM T-easy载体，将重组质粒送南京擎科生物科技有限公司测序，对测序结果通过DNAStar 软件进行同源性分析。

1.6 动物回归实验以0.2 mL/只的剂量将接毒收集到的尿囊液以肌肉注射方式接种5 只3 周龄SPF 雏鸡，另设对照组5 只以0.2 mL/只的剂量肌肉注射PBS 缓冲液，接毒组与对照组分笼隔离饲养，每日观察记录鸡的临床表现和发病情况，连续观察10 d。取死亡鸡肝脏组织进行研磨了提取病毒核酸进行PCR 鉴定。

2 结 果

2.1 病毒分离将研磨好的组织上清液接种卵黄囊盲传三代，鸡胚在24 h 后出现死亡，48～72 h 为死亡高峰期。死亡鸡胚主要表现皮下、背部出血，胚体小于同日龄正常鸡胚，生长发育缓慢（图1）。

图1 鸡胚组织病变

2.2 血凝实验通过尿囊液进行血凝实验，结果显示收获的尿囊液不能使1%鸡红细胞凝集，排除了禽流感、新城疫等血凝性病毒的感染。

2.3 PCR 鉴定琼脂糖凝胶电泳结果显示（图2），病料接种鸡胚收集的尿囊液经PCR 扩增得到的条带长度约667 bp，与预期扩增条带大小相符，送检发病鸡感染了禽腺病毒。

图2 尿囊液PCR 检测结果

2.4 测序与同源性分析测序成功的基因序列与GenBank 上禽腺病毒参考株的序列进行比较分析。结果显示，分离株与GenBank 上4 型FAdV 参考株同源性达99.2%，证实分离得到的毒株为血清4 型FAdV，将此毒株命名为GX20210602。

2.5 动物回归实验SPF 鸡接种病毒后2 d 内无明显临床症状。第3 d 有雏鸡出现精神沉郁，不喜动，并出现雏鸡死亡，死鸡剖检可见淡黄色透明心包积液，肾脏微微肿大，肝脏出血肿大，边缘呈土黄色（图3）。采集病死鸡和攻毒第5 d 的鸡肝脏，提取病毒核酸后进行PCR 鉴定，PCR 结果显示病死鸡检测阳性，对照组为阴性。

图3 剖检组织病变

3 讨 论

Ⅰ群禽腺病毒是国内家禽与野禽常见的传染性病原，血清4 型禽腺病毒在国内流行的Ⅰ群腺病毒占主要地位，鸡心包积水- 肝炎综合征是血清4型的显著特征，主要感染3～5 周龄的雏鸡，常呈隐性感染，感染鸡群免疫力下降，易于其他病毒形成混合感染，造成死亡率升高。研究证明腺病毒在肝脏，胰腺和肠管容易繁殖存活，Ⅰ群禽腺病毒可在鸡胚中繁殖，矫海婷等发现卵黄囊中的存在病毒滴度最高。本研究对送检有心包积液、肝炎临床症状，疑似感染FAdV-4 病料对肝组织研磨上清液，采用卵黄囊接种鸡胚方式进行扩增分离得到病毒，对分离毒株进行病毒鉴定，测序分析等一系列实验。

随着分子生物学的不断发展，PCR 方法因敏感性、检测效率高，在检测腺病毒方面应用广泛。禽腺病毒为DNA 病毒，六邻体蛋白(Hexon)是最主要的结构蛋白，对致病性密切相关，由于不同血清型病毒的Hexon 基因高度保守，根据Hexon 基因设计合成的特异性引物进行PCR 检测技术可以对不同的血清型进行诊断。本实验根据送检病鸡的临床症状判断FAdV-4 感染，根据Hexon 基因序列设计合成一对特异性引物，对分离毒株进行PCR 扩增，结果显示扩增条带与预期大小一致，怀疑该分离株为4 型禽腺病毒，切下目的条带进行纯化回收，与克隆载体进行连接转化，提取重组质粒，送至南京擎科生物科技有限公司进行测序，通过与GenBank 发布的Hexon 基因序列对比，发现分离株与4 型FAdV 参考株序列同源性达99.2%，证明分离得到的毒株为血清4 型Ⅰ群禽腺病毒，将此毒株命名为GX20210602。对GX20210602 毒株进行动物回归实验，剖检病死鸡可见肝脏出血，边缘呈现土黄色，心包有淡黄色积液产生，肾脏肿大较明显，实验结果符合FAdV-4 毒株的临床病理变化。

禽腺病毒可以垂直和水平传播，能长期潜伏于鸡群体内及排泄物中，传播范围广，对禽腺病毒的防治造成困难，这一株血清4 型禽腺病毒毒株的分离鉴定，为进一步研制血清型疫苗，以及对禽腺病毒的防控提供材料。