溶血、脂肪血及保存条件对HBV DNA、HIV RNA 核酸检测的影响

郝 丹

（华龙区妇幼保健计划生育服务中心，河南 濮阳 457000）

血液安全是关乎人们健康的重要举措，为了确保血液制品的安全，及早检出病毒变异以及隐匿性感染的污染血液，在对污染血液测定上，核酸检测是一种科学手段，借助这一技术能够对血液进行筛查［1］。但是实际进行核酸检测上，标本溶血、脂肪血等影响血液制品质量的因素明显影响核酸检测结果准确性，这样显然不利于疾病的早期诊断及治疗，因此进一步提高核算检测结果准确性也成为广泛关注的焦点话题之一［2］。为了寻找出适合本区域用于指导核酸检测操作的标本采集、运输、处理以及保存的合理控制对策，本次研究中对乙肝病毒脱氧核糖核酸与人类免疫缺陷病毒脱氧核糖核酸标本采集、运输、处理、检验、保存过程进行研究探讨，分析标本溶血、脂肪血、保存条件对于HBV DNA 与HIV DNA 检测结果的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2019 年1 月～2021 年1 月华龙区妇幼保健计划生育服务中心经血清学检测乙肝表面抗原、丙肝病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体均阴性的80 例透亮血浆标本。收集以上时间段HBV DNA、HIV DNA 测定阳性血浆，通过病毒浓度定量测定，制备12-30 倍核酸试剂以测定下限浓度HBV DNA、HIV DNA 标本。

1.2 方法

1.2.1 仪器、试剂 Coba s201 核酸检测系统（美国罗氏公司）；BC-3000 全自动细胞分析仪（迈瑞）；Bc-400 全自动生化分析仪（迈瑞）；DL-6M大容量低温离心机（长沙湘麓）；COBAS TaqScreen MPX V2.0test 核酸检测试剂盒（瑞士Roche 公司）；三酰甘油试剂盒（上海科华）；血细胞分析用溶血剂（迈瑞南京生物技术有限公司）。

1.2.2 溶血、脂肪血标本核酸检测 收集患者4h、24h、48h、72h、1周时间段结果均是阴性红细胞悬液以及严重的乳糜血浆。放入到温度大小在-80℃冰箱下进行保存，对相应标本进行离心处理，主要是3000r/min 的速度持续离心15min 分离血清溶血或者脂肪血样本、透亮血浆标本、12-30 倍LOD 浓度HBV DNA 与HIV DNA 标本，混匀后制备成血红蛋白浓度分别为97g/L、34g/L、17g/L、8g/L、5g/L、3g/L 溶血标准的样本，三酰甘油浓度分别为7.93mmol/L、3.80mmol/L、2.63mmol/L、1.83mmol/L、1.49mmol/L。

1.2.3 不同保存条件的标本核酸检测 HBV DNA 与HIV DNA 标本置于温度4℃、25℃、37℃、-30℃环境下保存，各环境下保存各组5 分样本，之后在4h、24h、48h、72h、1 周的时间段进行核酸检测，核酸检测借助实时荧光PCR 法在患检测系统上进行检测。

1.2.4 对照样品核酸检测 1 份HBV DNA 与HIV DNA实验标本、5 份血清学、核酸测定的结果为正常并且标本外观透亮混样标本，对照样品为无溶血以及正常TG 浓度情况，参照溶血与脂肪血标本核酸检查方法进行Hb、TG 浓度的测定。

1.3 统计学方法

采取SPSS20.0 软件进行数据结果分析，核酸检测应用重复测定的双因素方差分析方式，检验水准α=0.05，溶血、脂肪血、保存条件对核算检测结果影响数据应用单因素方差分析方法。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同标本保存环境下HBV DNA、HIV DNA 检测结果（见表1）

表1 不同保存条件HBV DNA 与HIV DNA 检测结果影响循环阈值（Ct）值的比较（n=80）

2.2 溶血、 脂肪血对HBV DNA 与HIV DNA 检测结果影响（见表2、表3）

表2 溶血与脂肪血标本不同Hb 浓度HBV DNA、HIV DNA检测影响Ct 值比较（n=80）

表3 溶血与脂肪血标本不同TG 浓度HBV DNA、HIV DNA检测影响Ct 值比较（n=80）

3 讨论

罗氏核酸检测系统是通过对扩增后产物进行同步检测，而若是血液标本存在溶血以及脂肪血情况，会对检测的性能造成影响［3］。血液标本发生脂肪血会对核酸检测的结果造成影响，主要是脂肪中乳糜微粒会屏蔽及吸收荧光，这样使得荧光发生淬灭的作用，明显降低荧光信号强度以及降低荧光扩散强度［4］。

标本保存条件的差异对于核酸检测结果造成的影响，主要显示室温环境、4℃环境、-80℃环境下经抗凝的标本，标本储存30d 后发现测定结果未见明显差异。而本次研究中，通过核酸检测HBV DNA，在37℃下保存72h 与1 周测定Ct 值明显比其他时间点高，这一结果表明随着保存时间的不断增加，存在核酸逐渐降解趋势，因此提示在实际的检测中需要提高重视，尤其是血液标本在夏季进行测定时候，为了避免标本出现变质及测定借助不准确情况，应将标本置于冷库中运输，避免因为标本变质引起的结果准确度降低情况［3］。HIV DNA 在不同环境以及时间下的测定结果差异基本一致，提示血液标本HIV DNA 可长时间保存，检测结果影响小，但是因为观察时间最长为1 周，对持续延长时间是否对结果造成影响的研究需要进一步探讨。

研究中，观察溶血组的HBV DNA、HIV DNA 检测结果除了在Hb 在97g/L 的时候受抑制未能准确检出外，而其他的Hb 浓度检测Ct 值检测指标差异无统计学意义，提示在各组其他的Hb 浓度下的HBV DNA、HIV DNA 检测未受血红蛋白浓度水平的影响。而本次研究表明高浓度TG 为对核酸检测结果造成影响。

综上所述，在进行核酸的检测中，采集的血液标本，当TG小于7.93mmmol/L 的时候，针对高血脂标本可接收，而进行检测时标本需同透亮的标本进行混合，而若是溶血标本超过34g/L 需要及时通知送检人员重新选择留取样本，并且血液标本采集后的72h 尽早进行检测，采血后标本运输也尽可能确保冷链完整，为检测结果准确性提供保障。