加味苓桂术甘汤对过敏性鼻炎大鼠的疗效及免疫调节机制的研究

彭晓夏，逯晓青，弓 强，王世晖，窦志芳

（山西中医药大学，山西 晋中 030619）

过敏性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）又称变应性鼻炎，是个体接触过敏原后，由免疫球蛋白E（IgE）介导、多种免疫细胞和炎症因子参与的鼻腔黏膜的变态反应性疾病，属于I 型变态反应性疾病［1］。其发病机制尚不十分明确，近年来研究显示辅助性T（T helper，Th）细胞在AR 的发病中起到重要作用，Th1/Th2细胞免疫失衡是AR 发生、发展的重要因素之一［2，3］。目前多采用抗组胺药物和鼻内皮质类固醇药物治疗AR，虽有一定疗效，但这些药物的耐药性较强，副作用较大，复发率一直在增加。中医药对AR 的防治由来已久，并且具有安全、可靠、疗效稳定、副反应少等优点，成为近年来研究的热点［4］。加味苓桂术甘汤常用来治疗过敏性鼻炎，疗效显著［5］。本研究在卵清蛋白诱导的AR 模型大鼠上，观察加味苓桂术甘汤对大鼠行为学积分、血清IgE 水平、组胺的分泌和Th1/Th2 型细胞因子产生的影响，初步探讨加味苓桂术甘汤在防治AR 中可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选SPF 级Wistar 健康雄性大鼠60 只，6～7 周龄，体重200±20g，由北京维通力华公司提供。大鼠的饲养：每日定时清洁，饲养温度20～25oC，相对湿度50%～70%，采用标准颗粒饲料饲养，自由饮水。

1.2 实验药物

加味苓桂术甘汤方药组成：茯苓10g、桂枝10g、白术10 g、炙甘草6g、苍耳子5g、细辛5g。上述中药均由山西中医药大学附属第一医院药房提供。向每付药中加入10 倍量的水煎煮1.5h，收集滤液；再向药渣中加入水煎煮1.0h，收集滤液，合并两次滤液，浓缩至50mL，4oC 保存备用。取氯雷他定片（广东逸舒制药股份有限公司，国药准字H20052214），用生理盐水配制成2g/L 的药液。

1.3 试剂与仪器

卵白蛋白OVA（美国Sigma 公司），氢氧化铝（北京化工厂），生理盐水（恒宁医疗器械有限公司），IgE、组胺、干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海博士德生物有限公司）。Multiskan SkyHigh 酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司），HC-2062 高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组与模型构建 选取60 只健康成年雄性大鼠，适应性喂养1 周，随机分为正常组15 只和造模组45 只。采用卵清蛋白（OVA）腹腔注射全身致敏联合滴鼻强化致敏的方法处理造模组大鼠构建AR 模型［6］：首先进行全身基础致敏，取1gOVA 和3gAl（OH）3溶于100mL生理盐水中配置成混悬液，取1mL混悬液进行大鼠腹腔注射，隔天1 次，共7 次；然后进行鼻部强化致敏，从第15 天开始，取0.05mL5%OVA 混悬液滴入大鼠双侧鼻腔，1 次/d，共14 次。正常组大鼠基础致敏阶段给予等体积的3%Al（OH）3混悬液腹腔注射，鼻部强化致敏阶段给予生理盐水双侧滴鼻。末次滴鼻30min 后观察大鼠抓鼻、打喷嚏和流鼻涕症状，统计行为学评分，具体评分标准如表1 所示，若总分≥5分，则可判定AR 模型建立成功。将AR 建模成功的40 只大鼠随机分为模型组13 只、中药治疗组14 只和阳性药物治疗组13只。

表1 过敏性鼻炎反应行为评分标准

1.4.2 给药方法 造模结束后，中药组大鼠给予加味苓桂术甘汤10g/（kg×d）灌胃（按照人鼠药物剂量换算公式计算给药剂量），阳性药物治疗组给予氯雷他定生理盐水1mg/（kg×d）灌胃，正常组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，1 次/d，共28d。

1.4.3 动物行为学观察 向大鼠每侧鼻孔滴50μL 卵清蛋白溶液，观察大鼠在3min 内挠鼻、打喷嚏的次数和流鼻涕的程度，按照过敏性鼻炎反应行为的评分标准（表1）进行打分。

1.4.4 血液样本的采集 将末次灌胃给药后的大鼠禁食不禁水饲养24h 后，采集血液样本。采用100g/L 水合氯醛腹腔注射处死大鼠，在眼底静脉丛取血，4oC 离心（3000r/min×20min），取上清液，于-80oC 储存、备用。

1.4.5 OVA-IgE、组胺、Th1 和Th2 细胞因子的检测 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测大鼠血清中IgE，组胺，Th1 型细胞因子IL-2、干扰素-γ（IFN-γ）和Th2 型细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。按照ELISA试剂盒的步骤进行检测。

1.4.6 统计方法 采用SPSS 21.0 软件进行数据分析，使用OriginPro 8.5 软件进行作图，实验数据以平均值±标准偏差（Mean±SD）表示。采用t 检验进行组间分析，P＜0.05 表示两组之间具有统计学差异。

2 结果

2.1 加味苓桂术甘汤对AR 大鼠行为学评分的影响（见表2）

表2 大鼠行为学评分比较（±s）

注：1）与正常组相比，P＜0.05；2）与模型组相比，P＜0.05

?

2.2 加味苓桂术甘汤对AR 大鼠血清中IgE 水平的影响（见图1）

图1 加味苓桂术甘汤对大鼠血清IgE 水平的影响（*表示两组间比较P＜0.05）

2.3 加味苓桂术甘汤对AR 大鼠血清中组胺水平的影响（见图2）

图2 加味苓桂术甘汤对大鼠血清组胺水平的影响（*表示两组间比较P＜0.05）

2.4 加味苓桂术甘汤对大鼠血清中Th1、Th2 细胞因子水平的影响（见表3）

表3 大鼠血清中细胞因子水平的比较（±s）

表3 大鼠血清中细胞因子水平的比较（±s）

注：1）与正常组相比，P＜0.05；2）与模型组相比，P＜0.05

组别IFN-γIL-2正常组8.122±0.3434.049±0.269模型组3.725±0.2381） 2.963±0.0741）阳性对照组 6.844±0.5502） 3.673±0.1332）中药治疗组 6.678±0.6712） 3.629±0.0522）IL-4 22.211±1.460 33.665±4.8011）24.088±1.6122）25.473±1.5052）IL-5 17.120±0.763 26.455±3.4731）18.507±0.9362）20.138±1.2412）IL-10 2.530±0.315 4，563±0.7011）3.401±0.2452）3.403±0.1942）IL-13 2.487±0.272 4.200±0.5441）3.396±0.2342）3.691±0.2312）TNF-α 6.753±0.575 13.786±0.7671）9.263±0.9122）9.661±1.1592）

3 讨论

AR 属于中医学“鼻鼽”的范畴，其主要症状为鼻塞、流清涕，是本虚标实之证，多由肺脾肾三脏阳气虚衰，津液不化而成痰、成饮，痰饮内停，又受外感邪气诱发而作。“肺气虚则鼻塞不利。”（《灵枢·本神》）肺开窍于鼻，肺主气，司呼吸，主治节，具有通调水道之职，肺气虚，不能摄津、布津，津液失司，则流清涕，津液停聚，阻塞肺之气机，气机不利则鼻塞。肺在体合皮，其华在毛，肺能够宣发卫气以熏肤、充身、泽毛，肺气虚，皮肤腠理不密，易受外邪侵袭，而发为鼻鼽。脾气虚，运化失司，清阳不升而鼻窍失养。鼻为肺窍，乃清气出入之道，脾气虚，不能运化水谷精微，清窍失于濡养，则鼻塞不通。脾为生痰之源，脾气虚，水湿运化失司，水湿内停而为痰为饮，痰饮聚于鼻窍则成鼻鼽。肾者水脏，主津液，肾阳虚，气化失司，水液失于气化，而内停为痰为饮。肾阳为一身阳气之根本，脾阳根于肾阳，肾阳虚衰则肺脾阳气均虚，肺脾肾阳气虚衰，加重津液代谢失常，水不能化为气而成痰成饮，加重鼻炎症状。此外，肾阳虚日久可以阴损及阳，而肾阴阳两虚，导致鼻鼽缠绵难愈。

Th1/Th2 细胞之间的平衡与AR 的发生、发展及机体的免疫状况密切相关，AR 患者体内存在Th1/Th2 比例失衡的现象。本课题成功复制了AR 动物模型，ELISA 检测显示模型大鼠血清中IgE 和组胺的水平高于正常组，说明AR 大鼠存在过敏和炎症反应；模型组大鼠IFN-γ 和IL-2 分泌减少，IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α 分泌增加，存在Th1/Th2 免疫细胞因子失衡的现象。

Th1 细胞能够介导保护性免疫，抑制炎症反应，增强免疫调节功能。IFN-γ 和IL-2 即是由Th1 细胞分泌的。IFN-γ 是抗呼吸过敏性疾病因子，是IL-4 合成的生物拮抗剂，可抑制IgE 的合成；IL-2 可促进NK 细胞增殖活化，抑制B 细胞合成IgE。Th1 细胞通过分泌IFN-γ 和IL-2 增强免疫调节功能，这与中医药健脾补肾益肺以扶正的作用具有趋同性。中医认为脾胃为后天之本，气血生化之源，“脾坚，则脏安难伤”（《灵枢·本脏》），脾虚，运化失职，水谷精微等营养物质不能运化于全身，则机体免疫功能低下。肾阳为一身阳气之根本，脾阳根于肾阳，肾阳虚，则脾阳亦虚，津液失于温化、失于运化而内停成痰，感受外邪则易发为AR。肺主气，司呼吸，肺气虚，则人体正气不足，抗邪无力，服具有补肺作用的肺气丸血清中IgG 含量明显升高，反证肺与机体的免疫功能密切相关［2，3］。

Th2 细胞具有促炎作用，会加重炎症反应，诱发AR。Th2 细胞分化增多，相关细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α分泌增加，导致IgE、组胺等病理产物聚集在鼻窍，发为AR。IL-4 是目前已知的能直接上调IgE 生成的细胞因子，能够诱导B 细胞活化、增殖、分化及分泌IgE［1，5］；IL-5 抑制Th1 细胞的免疫反应，抑制IFN-γ 产生，间接促进Th2 细胞的免疫反应；IL-10 则阻碍Th1 细胞的激活；IL-13 促进黏液的分泌；TNF-α则促进炎症反应、白细胞渗透、组织纤维化，是炎症状态的引发剂。AR 的主要病理变化为津液不化，壅塞气道阻塞鼻窍，发为鼻塞、流清涕。这一病理变化与AR 发作时病理产物IgE、组胺聚集于鼻窍等病理现象有相似之处。

加味苓桂术甘汤由苓桂术甘汤加苍耳子、细辛而成，方中茯苓、白术甘淡，能够健脾利水而除湿；佐以桂枝辛温，通阳化气，温复阳气，阳气复则气行，气行则津行，津行则水去痰化；甘草甘平，平补脾胃，并且调和诸药，四药合用温化水饮，健脾利湿，以治饮成之本。现代药理研究表明，茯苓具有增强免疫功能、抗炎、抗迟发性超敏反应的作用；桂枝具有抗炎、抗过敏作用；白术具有免疫调节、抗炎抗菌作用；甘草能够增强机体免疫调节功能，具有抑制肥大细胞脱颗粒、抗过敏的作用。细辛和苍耳子均入肺，肺开窍于鼻，二药辛散走窜，能够直入鼻窍，进而通鼻窍、散风寒，以治其标。苍耳子具有抗过敏、抑菌、抗炎和镇痛、抗肿瘤、免疫抑制等作用；细辛在一定程度上可以修复受损伤的鼻黏膜，减少鼻黏膜上皮的脱落，减轻毛细管的水肿和充血状态，还可以调节免疫平衡。苓桂术甘汤与二药配伍温中健脾，化痰利水，散寒开窍，既治肺脾肾虚衰之本，又治痰饮内停，鼻窍阻塞之标，标本同治，进而有效地治疗过敏性鼻炎。

本研究结果表明，灌服加味苓桂术甘汤后，治疗组大鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平显著升高，而AR 症状评分、血清IgE 水平、组胺分泌、细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α 水平均显著降低。说明加味苓桂术甘汤通过温中健脾，升高大鼠血清IFN-γ 和IL-2 水平以治AR 之本，通过散寒开窍降低血清IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-α 水平，进而降低IgE 水平和组胺分泌，减少聚集在鼻窍的病理产物，宣通鼻窍，以治其发作之标。推测加味苓桂术甘汤防治AR 的作用可能与调节Th1/Th2细胞免疫平衡有关，然而关于其调控Th1/Th2 的作用机理还有待于后续深入研究。