ESBLs 及TET（X4）基因大肠埃希菌肺炎临床特征比较

徐存来，曹卓，蒋奕薇，王欣，王馨怡

大肠埃希菌是临床上人类常见肺炎的致病菌之一，也是携带超广谱内酰胺酶（ESBLs）和四环素类黄素依赖性单加氧酶TET（X）等抗药基因细菌中最常见的一种[1]。2019 年，有研究人员从动物样本中分离了来自大肠埃希菌属的TET（X）新型变异体，其编码的蛋白与TET（X）具有93.8%的同源性，故称TET（X4）[2]，该研究表明其位于接合转移型的质粒上。四环素类耐药性可在细菌间转移和介导，包括米诺环素和临床使用的替加环素。其对我国肺炎患者健康造成严重威胁，将对替加环素的使用及临床多重感染的治疗提出严峻挑战。所以，本研究围绕它进行流行病学研究和临床特点研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究为前瞻性分析，纳入2020 年1 月至2022 年12 月在丽水市人民医院住院且肺泡灌洗液经细菌培养和mNGS 法测出含有ESBLs 或TET（X4）耐药基因的大肠埃希菌的肺炎患者。排除标准：（1）3 份肺泡灌洗液经细菌培养均未培养和鉴定出大肠埃希菌；（2）另在入组过程中mNGS 法初筛发现3 例ESBLs（+）TET（X4）（+）大肠埃希菌肺炎患者，因样本量太少不具有可比性，故本研究予以排除。A 组为ESBLs（+）TET（X4）（－）大肠埃希菌肺炎患者mNGS 法初筛150 例，排除15 例，入组135例。B 组为ESBLs（－）TET（X4）（+）大肠埃希菌肺炎患者入组初筛100 例，排除18 例，入组82 例。收集患者一般资料、基础疾病及用药情况，并在患者出院后随访30 d。本研究经丽水市人民医院医学伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 在本院支气管镜室使用奥林巴斯290 电子纤维支气管镜经过虚拟导航系统指引下在肺炎病变区域进行4 次肺泡盥洗术，第一次留取肺泡灌洗液送mNGS，另再次盥洗3 次肺泡灌洗液送普通细菌培养。样本至少需要采集5 ml，在接受检测前都保存在液氮中。

1.2.2 mNGS 法检测 采用杭州杰毅公司基于Illumina测序平台和建库技术，采用Q-mNGS定量宏基因组检测对核酸进行高通量测序，利用生物信息学进行比对。具体序列：TET（X4）-F：5’-AATGGAAACCGGCTAATGGC-3’；TET（X4）-R：5’-TGTCGCTAACCCTACAAAAGATG-3’。ESBLs（+）-F：5’-ATAGGTCACCAGAACCAGCG-3’；ESBLs（+）-R：5’-G TTGGTGACGTGGCTCAAAG-3’。大肠埃希菌在种水平上检出的序列数是其他所有同类病原体的十倍判定为阳性。1.2.3 菌种鉴定及药敏试验 菌种鉴定采用IVDMALDIBIOTYPER 2.3 飞行质谱仪，药物敏感性试验：使用VITEK2-TechnologyAST-GN13 药物敏感性卡，若3 次送检有至少1 次肺泡灌洗液细菌培养或菌种鉴定大肠埃希菌则判定为有效。

1.3 统计方法 采用SPSS25.0 统计软件进行分析，计数资料采用检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A 组与B 组临床特征及预后比较 B 组从事农林畜牧业、长期使用塑料制品、四环素及30 d死亡率均高于A 组（均P ＜0.05），见表1。

表1 A 组与B 组临床特征及预后比较例（%）

2.2 A 组与B 组耐药性比较 B 组对四环素、米诺环素、替加环素的耐药率比A 组高（均P ＜0.05），但对头孢（头孢曲松、头孢他啶、头孢吡啶、头孢唑林）和青霉素（阿莫西林克拉维酸钾、氨曲南、氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦）的耐药率较A 组低（均P ＜0.05），见表2。

表2 A 组与B 组耐药性比较例（%）

3 讨论

一项针对16 个省63 个畜牧场的4 000 份样品调查中，TET（X4）阳性大肠杆菌的流行率为1.0%[3]，这表明TET（X4）耐药基因已在我国养殖场传播。TET（X4）替加环素耐药基因在我国健康人群中的检出率为4/5 845（0.07%）[3]，这说明我国社区获得性肺炎的患者也存在替加环素耐药的潜在风险。除此以外，新加坡的研究表明在临床大肠埃希菌肺炎患者中TET（X4）检出率为11/109（10.1%）[4]。替加环素在国内外从未被批准在养殖场使用，其高昂的价格和相对稀缺的供应也使得农牧民私自使用不经济而且不现实。但既往研究却从养殖场中检测到TET（X4）大肠埃希菌[3]，这可能是由于四环素、土霉素和金霉素，因其低廉的价格和已被临床淘汰的现实，在农牧业中得到了长期广泛使用所施加的抗生素选择压力所致[4]。

本研究结果显示长期（1 个月内）使用塑料制品进食或饮水（塑料水杯、塑料袋及塑料餐具）会增加大肠埃希菌肺炎患者携带TET（X4）耐药基因的风险。一项针对河流的抗生素抗性基因检测研究表明，四环素抗性基因TET（X4）在聚丙烯和聚乙烯塑料上可能有更多的潜在宿主[5]。尽管经过处理，自来水中仍能检测到四环素抗性基因TET（X4），这表明四环素抗性基因TET（X4）在自来水中持续存在[6]。聚丙烯、聚乙烯塑料制品清洗不充分或老化后产生裂纹，导致微生物聚集，形成生物膜，可能是四环素抗性基因TET（X4）蓄积的潜在环境，也可能是耐药菌的生存环境，但还有待进一步研究确认。

本研究结果显示B组从事农林畜牧业率同样高于A 组。四环素类是治疗奶牛最常用的畜牧用消炎药[7]，且有研究表明牛奶中可以测出四环素类残留，而四环素抗性基因TET（X4）能在土壤中持续数月，也可以在牛场的新鲜粪便中检测到[8]。因此，四环素抗性基因TET（X4）可能在农牧环境或者新鲜未彻底加工消毒食物中蓄积，可能通过食物链和生活行为接触进入大肠埃希菌患者体内，从而导致人体抗药性的出现。这也说明从事家林畜牧业、长期使用塑料制品对四环素类耐药高有关，推测四环素非医疗行业有关，值得宏观控制。

在耐药性方面，B 组比A 组对四环素（四环素、米诺环素、替加环素）药物的耐药率要高。但对头孢（头孢曲松、头孢他啶、头孢吡啶、头孢唑林）和青霉素（阿莫西林克拉维酸钾、氨曲南、氨苄西林、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦）耐药率较A 组低（均P ＜0.05），这与文献[9-10]报道相符。A 组对头孢菌素类和青霉素类耐药性高可能与抗生素滥用有关，这提示医疗机构及药店应进一步严格控制头孢菌素类和青霉素类药物滥用予非细菌感染或者非敏感细菌感染，医疗机构应注意医务人员手卫生和耐药菌感染患者接触隔离，从而避免耐药性传播。B 组30d 内死亡率高于A组，这可能与TET（X4）介导的替加环素治疗失败有关，但目前还有待前瞻性多中心大规模研究进行确认。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明徐存来：实验操作、论文撰写；曹卓、蒋奕薇、王欣、王馨怡：数据整理、统计学分析