运动康复对心肌梗死大鼠心脏纤维化及心功能的影响

吴长勇，王 睿，保苏丽，李锐洁，孙 煌，叶雨佳，徐 菲，彭云珠

（昆明医科大学第一附属医院心内科，云南 昆明 650032）

心血管疾病是全球人类死亡的主要原因之一[1]，位于我国城乡居民疾病死亡构成比首位，患病人数高达3.3 亿，其中冠心病达1 139 万，仍处于持续上升阶段[2]。心肌梗死（myocardial infarction，MI）以高患病率、高住院率和高死亡率为特点，明显增加了患者家庭和社会的经济与精神负担。目前冠状动脉介入治疗仍是MI 最主要的治疗手段，随着医疗器械和诊治水平提高，MI患者生存率不断提高，但术后的管理尤为重要。目前国内外指南均指出心脏康复是二级预防的重要指标[3-4]，且运动康复作为中心元素，是一种非药物性和非创伤性的干预措施，通过减少活性氧产生及炎症反应、增加梗死灶周围血管生成，减少梗死面积和心脏纤维化，改善心功能，提高心血管疾病事件后的生存率[5]。研究表明，自噬是心血管疾病预后的重要调节机制，过度的自噬或自噬不足将导致心血管事件发生[6]。因此，本研究基于MI 大鼠模型，探究运动康复对心肌梗死大鼠心脏纤维化及心功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物选取3～4 个月、体重180～220 g 雄性SD 大鼠30 只，购于昆明医科大学实验动物学部[许可证号：SYXK（滇）K2020-0006]，其中构建MI 模型中因心室颤动和气胸死亡2 只；术后1 周内因肺部感染死亡2 只；实验过程中因MI 后心力衰竭死亡2 只，最终共纳入24 只大鼠。分笼饲养（每笼3～4 只），保持恒定的12 h 光－暗周期，随意进食和饮水。饲养1 周适应环境。本研究通过昆明医科大学实验动物中心及实验伦理委员会批准（伦理批号：kmmu20221866）。

1.1.2 主要仪器设备大鼠轮转式跑步机（YLS-15A，济南益延科技发展有限公司）、超高分辨率小动物超声成像系统（Vevo3100，FUJIFILM VisualSonics 公司）、小动物呼吸机（ALC-V8S，上海奥尔科特生物科技有限公司）、全息扫描显微镜（Pannoramic Confocal，丹吉尔3DHISTECH 公司）、透射电子显微镜（CM101，荷兰Philips）。

1.1.3 主要试剂苏木素（Sigma，H31316）、伊红（Sigma，230251）、Masson 染色试剂盒（Solarbio，G1340）、Tunel 检测试剂盒（ThermoFisher，C10617）。

1.2 实验方法

1.2.1 构建MI 模型建模前禁食4～6 h，戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉，固定，连接小动物呼吸机和心电监护仪，呼吸机参数：潮气量（3 mL/100 g）、呼吸频率60～80 次/min、呼吸比2∶1。常规消毒铺巾，开胸暴露心脏，6-0 丝线于左冠状静脉主干肺动脉圆锥下缘2～3 mm 处结扎LAD，建模成功的指标：肉眼可见结扎远端心肌颜色变浅或变白，心电图ST 段弓背向上抬高或T波倒置。探查胸腔无出血后逐层关胸。假手术组只穿针引线，余步骤同MI 组。大鼠自主呼吸恢复后撤离呼吸机，术后抗感染治疗3 d。

1.2.2 实验分组术后1 周大鼠处于稳定期，随机分为4 组：MI-E 组（n=6）、MI-Sed 组（n=7）、Sham-E 组（n=6）和Sham-Sed 组（n=5）。

1.2.3 运动方案参照既往研究与前期预实验共同制定[5]：适应性运动1 周：10 m/min×10 min，20 min/d，5 d/周；正式运动4 周：每次开始前以10 m/min×10 min 为热身运动，再以20 m/min×7 min 和15 m/min×3 min 交替运动3 组，40 min/d，5 d/周。不运动组全程不参与运动训练。

1.2.4 左心室结构与功能检查运动训练结束后1 d 行超声心动图检查[7]。心前区褪毛，七氟烷吸入麻醉，固定，连接心电监测，心率控制为350～400 次/min，用MX250 探头，频率为20 MHz于左室长轴切面M 型测量左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室前壁收缩末期和舒张末期厚度（AWTs，AWTd）和左心室后壁收缩末期和舒张末期厚度（PWTs，PWTd），所有测量值均至少从3 个代表性周期中进行，并取平均值。计算左心室射血分数（left ventricular eject fraction，LVEF）和短轴缩短率（fraction shortening，FS），其中LVEF%=（LVEDD^2-LVESD^2）/LVEDD^2 ×100+[100-（LVEDD^2-LVESD^2）/LVEDD^2 ×100] × 0.15，FS%=（LVEDD-LVESD）/LVEDD ×100。

1.2.5 心脏标本制备和保存摘取心脏，修剪残余组织及清洗残血，沿结扎线以下从心尖到心底垂直方向横切（即沿左室短轴切面横切）取部分组织于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋固定，用于HE、Masson 和Tunel 染色；取心肌梗死与正常组织交界区于电镜液保存，用于透射电镜检测。

1.2.6 组织学检测石蜡脱水及包埋固定，HE染色拍照后用3DHISTECH/Case Viewer 图像软件观察心肌细胞损伤；Masson 染色分析心肌纤维化水平，通过Image J 图像处理软件计算心肌梗死面积比即胶原容积分数（collage volume fraction，CVF），CVF%=（蓝色胶原纤维面积/心肌切面总面积）× 100%，可表示心肌纤维化水平；Tunel 染色观察心肌细胞凋亡，每张切片取3 个高倍镜视野，计算细胞凋亡指数=（阳性凋亡心肌细胞核数/总细胞核数）× 100%，并取平均值。

1.2.7 自噬小体检测将组织切成1 mm×1 mm×1 mm 的小块，通过固定（2.5%戊二醛和1%锇酸溶液）、脱水（乙醇梯度和丙酮）、浸透（100%丙酮∶树脂）、包埋（Epon 812 树脂）、烘箱聚合（37℃12 h，45℃ 12 h，60℃ 48 h）步骤制作成50～70 nm超薄切片，使用醋酸双氧铀染色15 min、柠檬酸铅染色10 min 染色干燥后在透射电镜下观察自噬小体和心肌细胞超微结构。

1.3 统计学处理

采用SPSS 25.0 统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示。行方差性检测，若方差齐（P>0.05）则采用ANOVA 单因素方差分析，LSD-t检验比较两两之间差异；若方差不齐（P<0.05），则采用近似检验DunnettT3 进行统计推断，以P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 分析4 组大鼠超声心动图指标

与Sham 组比较，MI 组AWTd、AWTs、PWTd、PWTs、LVEF 和FS 降低，LVEDD 和LVESD 增大，以MI-Sed 组明显（P<0.05）；MI-E 组与MI-Sed组比较，LVESD、LVEF 和FS 差异有统计学意义（P<0.05）；Sham-E 组与Sham-Sed 组比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 4 组大鼠超声心动图指标（）Tab.1 Parameters of echocardiography in four groups of rats（）

表1 4 组大鼠超声心动图指标（）Tab.1 Parameters of echocardiography in four groups of rats（）

组间比较，aP <0.05；与MI-E组比较，*P <0.05；与MI-Sed组比较，#P <0.05。

2.2 HE 染色结果

Sham 组心肌细胞结构完整和排列紧密有序，肌纤维方向走形一致，局部呈灶状的炎性反应；MI 组出现不同程度的心肌细胞溶解，细胞结构模糊和边界不清，伴炎性细胞浸润，成纤维细胞增生，而MI-E 组心肌细胞损伤程度较轻，见图1。

图1 心脏组织HE 染色（×400）Fig.1 HE staining of heart tissue（×400）

2.3 Masson 染色结果

Sham 组心肌细胞排列紧密有序，局部呈灶状纤维化改变；MI 组大鼠心肌细胞排列严重紊乱，心肌纤维化程度明显增加。CVF%在4 组间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中MIE 组与MI-Sed 组、Sham-E 组与Sham-Sed 组相比较，CVF%降低（P<0.05），见图2。

2.4 Tunel 染色结果

与Sham 相比，MI 组心肌细胞凋亡数量明显增多（P<0.05）。而MI-E 组较MI-Sed 组心肌细胞凋亡数量减少（P<0.05）；Sham-E 组较Sham-Sed 组心肌细胞凋亡数量减少（P<0.05），见图3和表2。

图3 心脏组织Tunel 染色（×400）Fig.3 Tunel staining of heart tissue（×400）

表2 4 组大鼠细胞凋亡指数[（），%]Tab.2 A poptosis index in four groups of rats [（），%]

表2 4 组大鼠细胞凋亡指数[（），%]Tab.2 A poptosis index in four groups of rats [（），%]

组间比较，aP <0.05；与MI-E组比较，*P <0.05；与MI-Sed组比较，#P <0.05；与Sham-E组比较，+P <0.05。

2.5 透射电镜检测结果

Sham 组心肌细胞形态正常，线粒体结构完整，肌纤维束排列有序，视野下基本未见自噬小体。MI 组心肌细胞损伤严重，细胞结构紊乱，线粒体嵴中断、排列紊乱，肌纤维束疏松紊乱，间质水肿，视野下可见自噬小体形成；而MI-E 组的自噬小体较MI-Sed 组稍多，见图4。

3 讨论

本实验通过制作大鼠MI 模型，运动训练5 周发现，与Sham 组比较，MI-E 组和MI-Sed 组大鼠AWT、PWT、LVEF 和FS 降低，LVEDD 和LVESD 升高，差异具有统计学意义，提示MI 后大鼠左心室结构与功能发生改变。但实验也发现MI-E 组大鼠左室壁厚度和收缩功能较MI-Sed 组有所改善，表明运动在一定程度上能改善MI 大鼠的左心室功能，见表1。

MI 后心肌细胞发生一系列病理生理反应，包括炎症反应、缺血再灌注损伤和活性氧增加、心肌细胞再生与增殖、线粒体与能量代谢、神经激素激活、左心室几何构型改变、心肌肥厚以及心肌纤维化形成，其中主要表现为左心室重塑[8]。左心室重塑是指心脏通过调节心室大小、形状和功能对机械、激素的不良适应。目前，虽然通过血运重建、抗动脉粥样硬化、抗心力衰竭以及增加微循环供血治疗的同时具有改善心肌纤维化和调控心肌细胞的生长的作用，但不具有特异性和持续性。MI 后的不良重塑是发病率和死亡率的重要决定因素，导致了心脏传导系统异常、顺应性降低及心功能障碍，导致心律失常、心力衰竭甚至死亡，明显降低了生存率。

3.1 运动减少心肌细胞凋亡及梗死面积，改善心脏纤维化和泵血功能

运动是一种非药物性和非创伤性的干预措施，作为心脏康复的中心元素，有益于降低心血管疾病的再住院率及死亡率，提高心血管疾病事件后的生存率。本实验发现与Sham 组相比较，MI 组CVF%和细胞凋亡指数明显增加，差异具有统计学意义，这表明MI 后大鼠心肌纤维化和心肌细胞凋亡明显增加，但运动训练5 周后MI-E 组的心肌细胞损伤程度、CVF%和细胞凋亡指数低于MI-Sed 组，而LVEF 和FS 高于MI-Sed 组，差异具有统计学意义，见图2 和表2。Lai 等[9]研究表明游泳运动可降低TNF-ɑ水平、caspase-3 活化，增强BCL-2 蛋白表达，减少心肌细胞凋亡数量，改善心肌损伤和梗死面积。间歇性有氧运动4 周可降低Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维表达，抑制心肌间质胶原沉积，明显降低MI 大鼠的LVSP 和CVF%，明显提高±dp/dt 和LVEDP，改善左心室的心脏纤维化及心功能[10-11]。Li 等[5]研究发现MI 大鼠分别通过有氧、抗阻和振动运动训练8 周后，LVIDd 和LVIDs 较对照组明显降低，而LVEF 明显升高，其中抗阻运动训练改善左心室结构与功能效果更明显，以上研究表明运动可改善MI 后左心室重塑，进一步改善心功能。

3.2 运动减少心肌细胞超微结构损伤，诱导心脏自噬发挥保护作用

本研究也发现运动训练可减少MI 大鼠心肌细胞和线粒体损伤，适度诱导自噬水平发挥心脏保护作用，见图4。研究表明，运动可双向、动态调节心脏自噬水平及通量，清除损伤的线粒体，增加心肌细胞能量代谢，抑制心脏纤维化并改善心功能，发挥心脏保护作用[12-13]。MI 大鼠通过跑台、抗阻等运动训练的研究表明，运动可上调自噬，增强抗氧化能力，抑制氧化应激，改善心功能[5]。此外，急性运动可激活心肌细胞自噬，上调自噬水平，保护心脏免受有害的刺激[14]；长期运动可适当改变心脏自噬及其蛋白水平，延缓心脏病理性重塑，改善左心室结构与功能[15-16]。

总之，本实验基于心肌梗死大鼠模型研究发现，运动训练可改善左心室室壁厚度及心腔大小，减轻心肌细胞和线粒体损伤，降低胶原容积分数和心肌细胞凋亡程度，改善左心室收缩功能。此外，本实验还发现运动可诱导心肌梗死后的心脏自噬发挥心脏保护作用。但本实验局限于心肌梗死大鼠心脏组织学检测，后续仍需深入探究运动调控左心室重塑的病理生理作用及相关分子机制，并结合临床心脏康复模式，为运动康复提供一定的理论依据，这也是本课题组未来研究的重要方向。