靶向MPO的次氯酸荧光探针用于细胞成像

徐辉军，王玉婷，秦亚娟，厉廷有

南京医科大学药学院，江苏 南京 211166

髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）介导吞噬体内卤代氧化剂的产生，在细菌杀伤，保护身体免受疾病侵害中起关键作用［1］。Chen 等［2］研究发现MPO 活性与脑卒中相关，在短暂性大脑中动脉闭塞（transience middle cerebral artery occlusion，tMCAO）和永久性大脑中动脉闭塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）动物模型中，缺血皮层中的MPO 活性在缺血开始6 h 升高，在第5 天达到峰值，并在第15天逐渐恢复到基础水平。对缺血性卒中模型使用MPO 抑制剂KYC 可以减小脑梗死体积，保护血脑屏障，减轻神经缺损［3-5］。大量研究表明MPO 可以作为脑卒中的标志物，且MPO 抑制剂可以用于治疗脑卒中。

次氯酸（hypochloric acid，HClO）常被认为是中性粒细胞介导的细胞内杀伤微生物的活性物质。当过氧化氢存在时，Fe3+-MPO（天然酶）经历双电子氧化，形成化合物Ⅰ（·+por-Fe［IV］=O）和H2O。化合物I 可以通过卤化物（Cl-、Br-、I-，但不包括F-）或假卤化物（SCN-）的双电子还原转化为天然酶，在还原过程中产生各自的次卤酸（HClO、HBrO、HIO 或HOSCN），且由于血浆中Cl-的浓度远远高于其他卤化物，所以HClO 是MPO 卤化循环中最丰富和最重要的产物［6］。脑卒中发生后，MPO 被激活，引发HClO大量产生。

近年来，HClO 荧光探针的研究取得了显著进展，虽然已发表的探针在体外对HClO 均有很好的灵敏度、选择性、稳定性，且在细胞实验中获得了优秀的检测效果，然而其较短的激发和发射波长（一般情况下λex＜600 nm，λem＜650 nm）会带来多种问题，如可能会受到体内自身荧光信号的干扰、对生物样品产生光毒性以及可能出现光漂白现象等［7-8］。且它们没有靶向检测MPO 的能力，在体内使用受到限制。

本文以具有高光稳定性和近红外发射能力的硅罗丹明为荧光基团，通过酰肼硫脲键连接MPO的靶向基团KYC 合成SiRho-GABA-KYC（图1）［9-10］。HClO存在时硅罗丹明-硫氨基脲会发生环化反应并产生显著的荧光启动反应［11］。该探针可在体外特异性检测HClO，可用于细胞成像。

图1 探针SiRho-GABA-KYC结构Figure 1 The structure of SiRho-GABA-KYC

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器

1H NMR、13C NMR（400 MHz 核磁共振仪，JEOL公司，日本）；质谱（Agilent-6410 LC/MS，Agilent 公司，美国）；硅胶板（薄层层析用，青岛化工研究所）；多功能酶标仪（SYNERGY H1，BioTek 公司，美国）；气浴恒温振荡器（CHA-S THZ-82 ZD-85，江苏正基仪器有限公司）；台式低速冷冻离心机（CenLee 5R，湖南湘立科学仪器有限公司）；CO2培养箱（HERAcell 150i，Thermo Scientific 公司，美国）；紫外分光光度计（UV-2450，Shimadzu 公司，日本）；荧光分光光度计（FL-4600，Hitachi 公司，日本）；激光共聚焦显微镜（LSM 800，Zeiss公司，德国）。化学试剂除特殊说明外均为市售试剂。

1.1.2 细胞系与培养条件

HeLa细胞常规培养于含10%胎牛血清，80 U/mL青霉素，0.08 mg/mL 链霉素的DMEM 培养基，置于5%CO2，37 益的培养箱中。

1.2 方法

1.2.1 化合物的合成

化合物的合成方法如图2所示。

图2 化合物的合成方法Figure 2 Synthetic scheme for the compounds

1.2.1.1 xhj-2-1的合成

于氩气保护下，将3-溴-N，N-二甲基苯胺（10 g，50 mmol）溶于30 mL 无水四氢呋喃（THF）中，冷却至-78 益，加入正丁基锂（n-BuLi）（2.5 mol/L 的己烷溶液，22 mL，55 mmol），反应2 h 后，加入二氯二甲基硅烷（3.6 mL，30 mmol），升温至室温继续反应2 h。反应结束后，加冰水淬灭，减压浓缩除尽THF 后用乙酸乙酯（EA）萃取3 次，合并有机层，加无水硫酸钠（Na2SO4）干燥。有机相减压浓缩后通过硅胶柱层析［石油醚（PE）∶EA=50∶1］得浅黄色油状液体4.8 g，产率：64.34%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.25（d，J=5.6 Hz，1H），7.22（d，J=7.8 Hz，1H），6.93（d，J=2.7 Hz，2H），6.91（d，J=7.1 Hz，2H），6.76（dd，J=8.3，2.4 Hz，2H），2.92（s，12H），0.53（s，6H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：150.13，139.15，128.68，122.94，118.53，113.76，40.89，-1.95。高分辨质谱（HRMS）［离子源类型（ESI）］m/z：299.23［M+H］+。

1.2.1.2 xhj-2-2的合成

将xhj-2-1（1 g，3.35 mmol），2-羧基苯甲醛（2.52 g，16.8 mmol）和溴化铜（CuBr2）（75 mg，0.34 mmol）置于耐压管中，升温至140 益搅拌5 h。反应结束后，反应液冷却至室温，二氯甲烷（DCM）稀释后调节pH至碱性，用DCM 萃取3 次，收集有机相，无水Na2SO4干燥后减压浓缩，通过硅胶柱层析（PE∶EA∶Et3N=50∶1∶1）得粗品，再次通过硅胶柱层析（PE∶DCM=1∶10），所得粗品用EA/PE（石油醚）重结晶得淡蓝色固体300 mg，产率：20.86%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.95（d，J=7.6 Hz，1H），7.62（td，J=7.5，1.0 Hz，1H），7.53（dd，J=11.1，3.9 Hz，1H），7.29（d，J=7.7 Hz，1H），6.96（d，J=2.7 Hz，2H），6.78（d，J=8.8 Hz，2H），6.54（dd，J=8.9，2.8 Hz，2H），2.95（s，12H），0.64（s，3H），0.60（s，3H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：170.90，154.57，149.44，137.17，133.85，128.86，128.34，127.21，125.82，124.76，116.79，113.48，92.06，40.48，0.63，-1.32。HRMS（ESI）m/z：429.22［M+H］+。

1.2.1.3 xhj-2-3的合成

将xhj-2-2（44 mg，0.10 mmol）溶于5 mL 乙醇（EtOH）中，升温至80 益，加入85%水合肼（0.2 mL，3.48 mmol），搅拌回流4 h，反应结束后减压浓缩。浓缩液用EA 稀释，饱和食盐水洗涤3 次，收集有机相，加无水Na2SO4干燥。有机相减压浓缩后通过硅胶柱层析（PE∶EA=3∶1）得8 mg 无色油状液体，产率：17.63%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.95～7.86（m，1H），7.34～7.26（m，2H），6.89（d，J=2.8 Hz，2H），6.88～6.85（m，1H），6.73（d，J=9.0 Hz，2H），6.63（dd，J=9.0，2.9 Hz，2H），3.68（s，2H），2.94（s，12H），0.60（s，3H），0.57（s，3H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：167.79，153.66，149.02，135.79，132.59，130.33，128.82，127.90，127.48，123.83，122.95，116.19，115.34，73.72，40.43，1.12，0.27。HRMS（ESI）m/z：443.26［M+H］+。

1.2.1.4 isoGABA的合成

将二硫化碳（1.74 mL，28.93 mmol）加入到γ-氨基丁酸（GABA）（1 g，9.7 mmol）和Et3N（3.4 mL，24.5 mmol）的THF/H2O（7 mL/7 mL）溶液中，于室温搅拌14 h 后，冷却至0 益，缓慢滴加碘（I2）（2.7 g，10.6 mmol）的THF（7 mL）溶液，滴加完毕后于0 益继续反应3 h。反应结束后，向反应液加入6 mL 2 mol/L稀盐酸 和Na2SO3（0.24 g，1.9 mmol），加 入EA 分层，取有机层减压浓缩后通过硅胶柱层析（PE∶EA=2∶1）得浅棕色油状液体1.34 g，产率：95.2%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.32（s，1H），3.67～3.55（m，2H），2.50（dd，J=9.0，5.3 Hz，2H），2.06～1.90（m，2H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：178.69，131.06，44.35，30.83，25.04。

1.2.1.5 SiRho-GABA-OH的合成

将xhj-2-3（550 mg，1.24 mmol）和isoGABA（4.32 g，29.76 mmol）溶于干燥无水N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（20 mL）中，在氩气保护下于90 益搅拌过夜，通过TLC 监测反应。反应完成后，冷却至室温，EA反复萃取3 次，收集有机层。有机层用饱和食盐水冲洗3 次后，无水Na2SO4干燥，减压浓缩后通过硅胶柱层析（PE∶EA=1∶1）得淡绿色固体440 mg，产率：60.2%。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.97（d，J=7.1 Hz，1H），7.63～7.51（m，2H），7.12（d，J=7.5 Hz，1H），6.88（s，1H），6.83（d，J=2.8 Hz，2H），6.56（dd，J=9.0，2.9 Hz，2H），6.48（d，J=8.9 Hz，2H），5.72（t，J=5.8 Hz，1H），3.22（dd，J=13.0，6.7 Hz，2H），2.92（s，12H），2.08～1.99（m，2H），1.44～1.32（m，2H），0.53（d，J=4.3 Hz，6H）。13C NMR（101 MHz，CDCl3）δ：182.91，177.83，168.00，153.26，149.24，137.95，134.40，129.88，129.35，129.20，128.72，124.72，123.93，115.92，114.76，73.75，43.92，40.22，31.07，23.83，0.36，-0.59。质谱MS（ESI）m/z：586.41［M-H］-。

1.2.1.6 SiRho-GABA-KYC的合成

树脂溶胀：称取Rink Amide 树脂（0.97 g，0.71 mmol），加入DMF（9 mL）充分振摇使溶胀树脂，30 min后抽干DMF。DMF洗涤6次，振摇5 min/次。

肽键的形成：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振摇5 min，抽干；再次加入相同的DMF溶液（9 mL），振摇40 min，抽干；DMF 洗涤6 次。加入Fmoc-Cys（Trt）-OH（2.5 eq，1 038 mg），六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷（PyBop）（2.5 eq，927 mg），1-羟基苯并三唑（HOBT）（2.5 eq，240 mg），N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）（4.0 eq，472 μL），DMF（9 mL），26 益恒温振摇4 h。抽干，DMF 洗涤6 次，每次振摇5 min，抽干。

二肽：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振摇5 min，抽干；再次加入相同的DMF 溶液（9 mL），振摇40 min，抽干；DMF 洗涤6 次。加入Fmoc-Tyr（tBu）-OH（2.5 eq，815 mg），PyBop（2.5 eq，927 mg），HOBT（2.5 eq，240 mg），DIPEA（4.0 eq，472 μL），DMF（9 mL），恒温26 益振摇4 h。抽干，DMF 洗涤6 次，振摇5 min/次，抽干。

三肽：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振摇5 min，抽干；再次加入相同的DMF 溶液（9 mL），振摇40 min，抽干；DMF 洗涤6 次。加入Fmoc-Lys（Boc）-OH（2.5 eq，834 mg），PyBop（2.5 eq，927 mg），HOBT（2.5 eq，240 mg），DIPEA（4.0 eq，472 μL），DMF（9 mL），恒温26 益振摇4 h。抽干，DMF 洗涤6 次，振摇5 min/次，抽干。

四肽：加入含20%哌啶的DMF（9 mL），振摇5 min，抽干；再次加入相同的DMF 溶液（9 mL），振摇40 min，抽干；DMF 洗涤6次。加入SiRho-GABAOH（1.05 eq，440 mg），PyBop（1.2 eq，460 mg），HOBT（1.2 eq，120 mg），DIPEA（2.0 eq，236 μL），DMF（9 mL），恒温26 益振摇4 h。抽干，DMF 洗涤6 次，振摇5 min/次，抽干。

树脂后处理：DMF 洗涤3 次，DCM 洗涤3 次，MeOH 洗涤3 次，DCM 洗涤3 次，MeOH 洗涤洗涤3 次，振摇5 min/次，洗涤后放入真空干燥器充分干燥。

在上述充分干燥的树脂中加入三氟乙酸（9.5 mL）和三异丙基硅烷（0.5 mL），恒温26 益振摇2 h，抽滤，滤液保存待用。此步骤重复2 次，合并3 次切割所得滤液，减压浓缩至小体积，加入冰乙醚析出沉淀，过滤干燥得粗品。溶解后用液相进行半制备。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.65（s，1H），8.00（dd，J=11.0，8.0 Hz，2H），7.90（d，J=6.9 Hz，1H），7.83（d，J=7.8 Hz，1H），7.76～7.56（m，5H），7.24（d，J=13.6 Hz，2H），7.04～6.93（m，5H），6.72～6.27（m，6H），2.97（dd，J=16.0，5.4 Hz，3H），2.89（d，J=3.2 Hz，12H），2.83～2.67（m，5H），2.25～2.18（m，1H），1.87（t，J=7.2 Hz，2H），1.63～1.35（m，4H），1.21（d，J=6.9 Hz，4H），0.49（d，J=14.1 Hz，6H）。MS（ESI）m/z：491.34［1/2M+H］+。

1.2.2 活性测试

1.2.2.1 光谱测量

紫外测定：在PBS（50%DMF，pH 5.0）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）与HClO（50 μmol/L，PBS）于37 益孵育30 min后检测紫外吸收光谱。

荧光测定：在PBS（50%DMF，pH 5.0）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）与HClO（50 μmol/L，PBS）于37 益孵育30 min后，检测激发光谱和发射光谱。

pH 稳定性：在不同pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.4、8.0、8.5）的PBS 缓冲液（50% DMF）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）与HClO（50 μmol/L）于37 益孵育30 min后，用620 nm激发检测波长681 nm处的荧光强度。

浓度依赖性：在PBS（50% DMF，pH 5.0）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）与HClO（0、0.25、0.50、0.75、1.00、2.50、5.00、10.00、20.00、25.00、40.00、50.00 μmol/L）于37 益孵育30 min后检测荧光光谱。

选择性：在PBS（50% DMF，pH 5.0）中，SiRho-GABA-KYC（5 μmol/L）与不同底物（50 μmol/L）于37 益孵育30 min后，用620 nm激发检测波长681 nm处的荧光强度。各组底物：①Control；②H2O2；③HBrO；④·OH；⑤tBuOO·；⑥ROO·；⑦TBHP；⑧ONOO-；⑨NO；⑩ NO；⑪ NO；⑫ Na+；⑬ K+；⑭ Ca2+；⑮ Mg2+；⑯ Zn2+；⑰ Cu2+；⑱ Fe3+；⑲ Cl-；⑳ I-；㉑ Arg；㉒ Gly；㉓ Glu；㉔ Cys；㉕ H2S；㉖ GSH；㉗ HOCl。

1.2.2.2 细胞毒性

取处于对数生长期的HeLa 细胞制成悬液并接种到96 孔板中（细胞密度约为5×104个/孔），于37 益，5% CO2的孵育环境中培养12 h，加入SiRho-GABA-KYC溶液（相当于细胞培养基中浓度为0、5、10、20、30、50 μmol/L），另设空白组（无细胞），每组设6 个复孔，于培养箱中继续孵育24 h，弃去上清液，加入100 μL无血清培养基和10 μL CCK-8溶液，继续培养1 h 后，在酶联免疫检测仪波长450 nm 处测量各孔的吸光值。

1.2.2.3 外源性HClO细胞成像

取处于对数生长期的HeLa 细胞制成悬液，加入到预先放置盖玻片的24孔板中，于37 益，5%CO2培养箱中培养12 h，弃去培养基，用PBS缓冲液清洗1 次，加入不同浓度的次氯酸钠（相当于细胞培养基中浓度为0、5、10、15、20、30 μmol/L）和opti-MEM 预孵育30 min后，更换opti-MEM，然后加入SiRho-GABA-KYC（细胞培养基中浓度为10 μmol/L，1%DMF）和Hoechst 33258（8 μmol/L）孵育30 min后，弃去上清液，用PBS 缓冲液清洗细胞3 次，加4%多聚甲醛于室温下固定15 min后，用PBS清洗3次，取出盖玻片，细胞贴壁面朝下置于载玻片（滴加5 μL 抗荧光猝灭剂）上，盖玻片四周用指甲油密封，避光，使用Zeiss LSM 800激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.3 统计学方法

实验数据结果采用GraphPad Prism7软件分析，符合正态分布的定量数据以均数±标准差（）表示。两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 探针的光谱特性

SiRho-GABA-KYC 加入HClO后，如图3A所示，紫外最大吸收波长位于660 nm。随后检测SiRho-GABA-KYC 与HClO 反应后的荧光发射，如图3B 所示，探针SiRho-GABA-KYC 和HClO 反应后，其最大激发波长位于660 nm，最大发射波长位于681 nm，但是使用660 nm 激发会影响发射光谱，所以使用620 nm作为激发波长。

图3 SiRho-GABA-KYC的光谱特性Figure 3 Spectral characteristics of SiRho-GABA-KYC

2.2 探针对HClO的浓度依赖性

检测SiRho-GABA-KYC 与不同浓度HClO 反应的荧光发射，如图4A 所示，发现随着HClO 浓度（0～25 μmol/L）的升高，荧光也逐渐增强。将681 nm处的荧光强度与HClO浓度（0～50 μmol/L）进行线性拟合，如图4B 所示，HClO 在0～25 μmol/L 的浓度范围内存在良好的线性关系（y=276.5x+70.51，R2=0.996）。

图4 SiRho-GABA-KYC的浓度依赖性Figure 4 Concentration dependence of SiRho-GABA-KYC

2.3 探针对pH的稳定性

为了检测探针在不同pH 环境中的稳定性及检测HClO 的效果，测定了pH 从4.0～8.5 共10 个pH 的纯探针以及与次氯酸反应的荧光强度。如图5 所示，探针本身在不同pH 的缓冲液中荧光强度基本不发生变化，说明探针受pH变化的影响很小，对pH稳定。当探针用于检测HClO 时，在pH 值为5.0 时荧光最强，于生理pH（7.35～7.45）范围时，探针对HClO仍有较强响应，因此该探针适用于细胞及体内成像。

图5 SiRho-GABA-KYC的pH稳定性Figure 5 pH stability of SiRho-GABA-KYC

2.4 探针对HClO的选择性

为了验证探针检测HClO 的选择性，对该探针与其他可能会与探针反应的活性氧或活性氮（H2O2、HBrO、·OH、tBuOO·、ROO·、TBHP、ONOO-、NO、、），生物硫醇（Cys、H2S、GSH），金属离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+），卤素离子（Cl-、I-）和氨基酸（Arg、Gly、Glu）的响应活性进行了检测，如图6 所示。探针对HClO 的选择性优于其他生物相关分子，只有HClO促进了荧光发射的显著增强，而在其他底物的存在下，探针的荧光光谱没有观察到明显的变化。在681 nm 处，探针对HClO 响应后的荧光增强相较其他检测底物＞30倍。

图6 SiRho-GABA-KYC的选择性Figure 6 Selectivity of SiRho-GABA-KYC

2.5 探针的响应机制

氧（硅）杂蒽螺环开环是检测次氯酸常用的一个识别基团，依照已有的研究猜测，它与HClO反应后，硅罗丹明-氨基硫脲基团成环，氧（硅）杂环形成共轭结构，如图7所示。

图7 SiRho-GABA-KYC与HClO的响应机制图Figure 7 Response mechanism of SiRho-GABA-KYC with HClO

为了研究探针与次氯酸是否如预期反应，设计此实验。现设置如下3组实验：①探针溶液，②探针与HClO 混合溶液，③产物溶液，在37 益孵育5 min后，使用液相进行分析，收集探针与目标产物的信号（图8）。探针与次氯酸的混合溶液中出现的新峰与产物峰保留时间一致，说明探针与次氯酸按照设想的机制进行反应。

图8 HPLC分析结果Figure 8 HPLC analysis

2.6 细胞毒性

用CCK-8 比色法进行探针的细胞毒性实验。结果如图9，HeLa 细胞与50 μmol/L 以下的SiRho-GABA-KYC孵育24 h后，细胞存活率超过90%，表明SiRho-GABA-KYC对HeLa细胞的毒性很小，生物相容性好，细胞对10 μmol/L的探针是完全可以耐受的。

图9 SiRho-GABA-KYC对HeLa细胞活力的影响Figure 9 Effect of SiRho-GABA-KYC on relative of cell viability of HeLa cells

2.7 外源性次氯酸成像

为了考察探针对细胞中外源性HClO 的成像能力，用不同浓度的HClO 处理HeLa 细胞（图10）。荧光强度随外源性HClO 浓度升高而增强，加入30 μmol/L HClO 孵育的荧光强度比对照组增强＞2 倍，表明探针能够有效检测HeLa 细胞的外源性HClO，且与HClO呈浓度依赖性增强。

图10 SiRho-GABA-KYC对细胞中外源性HClO的成像能力Figure 10 Imaging ability of SiRho-GABA-KYC for exogenous HClO in cells

3 讨论

HClO 是氧化应激中非常重要的一类生物标志物，它的过量产生与多种疾病密切相关。脑卒中发生后，MPO 表达量和催化活性上调，HClO 生成增加。目前，HClO 荧光探针的研究取得了显著进展，虽然这些HClO 探针在体外对HClO 均有很好的灵敏度、选择性、稳定性，但没有靶向检测MPO 的能力。在此前提下，设计合成了SiRho-GABA-KYC。该探针对HClO 响应较高，选择性好。细胞实验结果表明探针对细胞毒性小，对细胞外源性的HClO有较好的检测能力。希望可以对该探针进行深入的研究，用于生物活体成像，以期最终应用于脑卒中的诊断和治疗。