HPLC 法同时测定十五味骨伤丸中11 种成分

韩吴琦，吕 晋，方慧祥，牛英颖，刘威峰

（1.开封市食品药品检验所，河南 开封 475000； 2.曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000；3.云南省食品药品审核查验中心，云南 昆明 650106）

十五味骨伤丸是开封市中医院临床常用经验方［批准文号豫药制字Z20120842 （汴）］，由地龙、土鳖虫、人参、丹参、赤芍、制何首乌、红花、煅自然铜、儿茶、大黄、陈皮、菟丝子、女贞子、砂仁、三七组成，功效祛瘀活血、消肿止痛、续筋接骨，已有三十多年应用历史，临床效果良好，受到广大患者认可。但目前该制剂执行标准由医院自行制定，只对方中丹参进行了TLC 定性鉴别，未涉及其他成分，无法全面反映其质量，并且尚无关于其定性、定量研究的文献。因此，本实验建立HPLC 法同时测定十五味骨伤丸中儿茶素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷［1-4］、橙皮苷、丹酚酸B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、隐丹参酮、大黄酚、大黄素甲醚、丹参酮ⅡA的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AD 高效液相色谱仪（配置二极管阵列检测器）、UV-2550 紫外可见分光光度计（日本岛津公司）； MS205DU 电子分析天平（万分之一，梅特勒-托利多国际股份有限公司）； KQ-100VDB 三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 芦荟大黄素 （批号110795-202011，纯度98.3%）、大黄酚 （批号110796-201922，纯度99.2%）、大黄酸 （批号110757-201607，纯度100%）、大黄素 （批号110756-201913，纯度100%）、大黄素甲醚（批号110758-201817，纯度99.0%）、橙皮苷 （批号110721-202019，纯度96.2%）、儿茶素 （批号110877-202005，纯度99.2%）、丹酚酸B （批号111562-201917，纯度94.1%）、隐丹参酮（批号110852-201807，纯度98.7%）、丹参酮ⅡA（批号110766-202022，纯度99.5%）、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批号110844-201915，纯度90.7%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。十五味骨伤丸由开封市中医院生产，每瓶60 g，批号20210104、20210315、20210501、20210702、20210928。乙腈为色谱纯； 甲醇、磷酸为分析纯；水为超纯化去离子水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 依利特C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～20 min，13%A； 20～24 min，13% ～31%A； 24 ～50 min，31% ～58% A； 50 ～65 min，58% ～88%A； 65 ～75 min，88% ～13%A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长283 nm（0～25 min，儿茶素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B）、254 nm （25 ～75 min，大黄酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、丹参酮ⅡA、隐丹参酮）；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇制成贮备液（含儿茶素1 134.848 0 μg/mL、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷1 021.282 0 μg/mL、橙皮苷989.898 0 μg/mL、丹酚酸B 1 012.516 0 μg/mL、芦荟大黄素124.447 8 μg/mL、大黄酸 128.500 0 μg/mL、大黄素115.100 0 μg/mL、隐丹参酮1 074.843 0 μg/mL、大黄酚104.259 2 μg/mL、大黄素甲醚70.587 0 μg/mL、丹参酮ⅡA1 129.325 0 μg/mL），分别精密吸取适量，甲醇制成分别含儿茶素308.678 6 μg/mL、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷51.064 1 μg/mL、橙皮苷77.212 0 μg/mL、丹酚酸B 141.752 2 μg/mL、芦荟大黄素6.471 3 μg/mL、大黄酸7.710 0 μg/mL、大黄素19.567 0 μg/mL、隐丹参酮 5.374 2 μg/mL、大黄酚23.304 3 μg/mL、大黄素甲醚12.648 0 μg/mL、丹参酮ⅡA11.293 2 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取本品50 丸，研细，精密称取2 g，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，称定质量，超声处理30 min，冷却，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按本品处方工艺和比例，分别制成缺丹参、缺何首乌、缺儿茶、缺大黄和何首乌、缺陈皮的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰分离完全，对称性理想，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，甲醇稀释成7 个质量浓度，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得儿茶素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、隐丹参酮、大黄酚、大黄素甲醚、丹参酮ⅡA峰面积RSD 分别为0.39%、0.44%、0.35%、0.30%、0.46%、0.36%、0.41%、0.47%、0.40%、0.43%、0.37%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液（批号20210928），于0、2、4、8、12、16、24、48 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得儿茶素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、隐丹参酮、大黄酚、大黄素甲醚、丹参酮ⅡA峰面积RSD 分别为0.58%、0.84%、0.42%、0.55%、1.08%、0.92%、1.05%、0.88%、0.46%、0.74%、0.67%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批本品6 份（批号20210928），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得儿茶素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、隐丹参酮、大黄酚、大黄素甲醚、丹参酮ⅡA含量RSD 分别为0.51%、0.62%、0.44%、0.48%、0.88%、0.36%、0.41%、0.60%、0.56%、0.71%、0.59%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品（批号20210928） 6 份，每份约1.0 g，精密加入 “2.2.1” 项下对照品溶液适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，儿茶素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、隐丹参酮、大黄酚、大黄素甲醚、丹参酮ⅡA平均加样回收率分别为98.80%、98.98%、98.90%、99.11%、98.16%、98.95%、98.61%、99.59%、99.06%、99.10%、98.62%，RSD 分别为 0.67%、1.00%、0.41%、0.67%、0.84%、0.38%、0.34%、0.46%、0.78%、0.88%、0.46%。

2.3.7 样品含量测定 取5 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（μg/g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （μg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分选择 十五位骨伤丸中地龙、土鳖虫为动物药，含有大分子蛋白质，在二极管阵列检测器中无法检出； 煅自然铜为矿物药，主要成分为二硫化铁，上述仪器也无法检出。因此，本实验选择丹参、制何首乌、儿茶、大黄、陈皮所含主要成分［5-7］进行含量测定。

3.2 制备方法选择 参考文献［8-14］ 报道。

3.2.1 提取溶剂 本实验考察了50%甲醇、75%甲醇、甲醇、水、50%乙醇、95%乙醇，发现甲醇提取时各成分总含量较高，效果良好。

3.2.2 提取方法 本实验考察了超声提取、冷浸提取、回流提取，发现超声提取时操作简单，各成分总含量较高。

3.2.3 提取时间 本实验考察了提取时间15、30、45、60 min，发现提取30 min 时各成分总含量较高。

3.3 色谱条件选择

3.3.1 色谱柱 本实验考察了Waters、依利特、Inerstil 等不同品牌色谱柱，发现依利特色谱柱分离效果理想，重复性良好。

3.3.2 流动相 本实验考察了甲醇-0.1% 磷酸、乙腈-0.1% 磷酸、乙腈-0.5% 醋酸、乙腈-0.1% 甲酸，发现乙腈-0.1% 磷酸洗脱时各成分总含量较高。

3.3.3 检测波长 本实验将对照品溶液在190 ～400 nm 波长范围内进行扫描，发现儿茶素在280、210 nm，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在289、300 nm，橙皮苷在283、328 nm，丹酚酸B 在227、273、313 nm，芦荟大黄素在286、254 nm，大黄酸在229、257 nm，大黄素在252、265、288 nm，隐丹参酮在262、358 nm，大黄酚在256、277、286 nm，大黄素甲醚在266、287 nm，丹参酮ⅡA 在268、352 nm 附近均有最大吸收，为了确保各成分均可在最大吸收波长处进行检测，提高灵敏度，减少干扰，参考文献［15-23］报道采用254、283 nm 的波长切换方式。

4 结论

本实验采用HPLC 法同时测定十五味骨伤丸中儿茶素、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、橙皮苷、丹酚酸B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、隐丹参酮、大黄酚、大黄素甲醚、丹参酮ⅡA的含量，发现个别批次样品中一些成分含量偏低，可能与药材质量差异有关，应加以关注。同时，该方法简便、快速、准确，重复性良好，可为十五味骨伤丸质量标准研究提供参考。