复方百部止咳糖浆对百日咳小鼠免疫功能、TLR4/NF-κB 信号通路的影响

李 星，刘 琪，张潇予，张 伟，李竹英

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院呼吸科，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学研究生院，黑龙江 哈尔滨 150040； 3.黑龙江中医药大学附属第一医院儿科，黑龙江 哈尔滨 150040）

百日咳作为致婴幼儿死亡的急性呼吸道传染病之一，主要因百日咳杆菌引起［1］。在百日咳治疗上，从传统的多抗原全细胞百日咳疫苗到无细胞百日咳疫苗，在一定程度上降低了与百日咳有关疾病的发病率和死亡率，但却不能为机体提供持久的免疫力，使机体自身抵抗疾病［2］。中医认为，百日咳初期肺气宣发，邪气尚存，中、后期若能行润肺清嗓、清肺氧阴治疗，可使患儿逐渐康复［3］。复方百部止咳糖浆由百部、苦杏仁、桑白皮、麦冬、知母、黄芩、陈皮、甘草、天南星、枳壳、桔梗11味中药加工而成，具有清肺止咳功效，用于肺热咳嗽、痰黄黏稠、百日咳，收录于《卫生部药品标准》 中药成方制剂第六册［4］。Toll 样受体4 （Tolllike receptor 4，TLR4） 在固有免疫和获得性免疫中起桥梁作用，是炎症信号通路的门户蛋白，在免疫防御中广泛表达，TLR4 启动机体炎症参与入侵病原体的清除，在肺组织中表达升高亦会加重炎症损伤［5-6］。核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB） 是TLR4 调节的重要下游分子，其活化是炎症反应和免疫应答的关键调节机制，NF-κB 活化在肺疾病中引发肺部损伤和气道高反应性状态［7］。TLR4/NF-κB信号通路在百日咳中的作用机制尚未见报道，故本研究探讨复方百部止咳糖浆对百日咳小鼠呼吸道感染模型的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物 78 只4 周龄SPF 级BALB/c 雌性小鼠，体质量（11.23±1.14） g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京） 2019-0018］，在温度 （25±0.5）℃、相对湿度（55±5）%、自然光照环境下常规饲养。本实验经黑龙江中医药大学附属第一医院伦理委员会批准（伦理号2021LSD191）。

1.2 菌株 日本百日咳杆菌标准株Tohama Ⅰ株（上海金畔生物科技有限公司，批号M1917B） 在小鼠肺部进行毒力复苏，然后将其接种在琼脂培养基上，37 ℃培养40 h，在无菌室温环境下将含有菌落的培养液置于离心管中，4 000 r/min 离心10 min，弃培养基，收取菌液，添加TE 缓冲液悬浮菌液，加80%甘油，于-80 ℃保存。

1.3 试剂与药物 复方百部止咳糖浆 （批号20210613，重庆科瑞制药有限责任公司）； 罗红霉素片（批号20210326，石药集团欧意药业有限公司），用蒸馏水配制成4 mg/mL 混悬液。琼脂培养基，小鼠肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL） -1β、IL-6酶联免疫吸附（ELISA） 试剂盒，CD4-PE 抗体，CD8-FITC 抗体 （ 批号 HB0109-3、HB0402-5、HB1327-4、HB1325-9、HB1912-1、1913-2，青岛海博生物技术有限公司）； 苏木素-伊红（HE） 染色试剂盒、二氨基联苯胺显色试剂、蛋白裂解液（批号BZ-6012、BZ-7143、BZ-8017，北京索莱宝科技有限公司）； 羊抗鼠TLR4、NF-κB、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 单克隆抗体、羊抗鼠二抗 （ 批号ab71241、ab70558、ab79114、ab10871，英 国Abcam 公司）； BCA 试剂盒 （批号PAZ57112-K，上海碧云天生物科技有限公司）。

1.4 仪器 KW-DM-YWH 型小动物肺部定量雾化器、KC6700 型酶标仪（北京元森凯德生物技术有限公司）； F700 型小动物麻醉机、XK-SW002 型光学显微镜（北京友诚嘉业生物科技有限公司）；Auto40 型流式细胞仪、5200 型蛋白凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 66 只小鼠参考文献［8］报道建立百日咳模型，使用实验Tohama Ⅰ株（浊度3.8×1010CFU/mL，体积5 mL） 雾化30 min，感染7 d。实验过程中6 只小鼠死亡，其余60 只均表现为耸毛、精神萎靡、易受惊状态，培养菌落明显增加，表明模型建立成功［8］，成功率为90.91%。60 只小鼠随机分为模型组、阳性组（40 mg/kg 罗红霉素混悬液［9］） 和复方百部止咳糖浆低、中、高剂量组（0.715、1.43、2.86 g/kg，临床等效剂量的0.5、1、2 倍），每组12 只； 另取12 只同周龄正常小鼠作为对照组。复方百部止咳糖浆各剂量组小鼠每天灌胃给药2 次，阳性组小鼠每天灌胃给药1 次，对照组、模型组小鼠每天灌胃给予等体积蒸馏水，连续3 d。

2.2 一般状况观察 给药结束后，观察小鼠一般状况，包括精神、运动状态，皮毛、饮食饮水情况。

2.3 菌落计数检测 给药结束后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，在麻醉机吸气端、呼气端、储气囊口采集标本，无菌棉球在麻醉机管腔内壁平速移动2 cm 擦拭取样，取样后同一样品置于同一5 mL 琼脂培养基上振荡，取0.5 mL 接种在无菌培养基上，37 ℃培养箱中培养48 h，菌落计数。

2.4 样本采集 取小鼠腹主动脉血4 mL，分成2份，一份室温静置1 h，1 000 r/min 离心10 min，取上清用于炎症因子水平检测； 另一份用于CD4＋、CD8＋T 细胞比例检测。取血后小鼠颈椎脱臼，胸骨剑突处沿着胸骨正中剪开皮肤，肋骨下缘两侧剪开横骨，提拉胸骨暴露出双肺，小心取出，左肺置于4%多聚甲醛中固定，右肺置于-80 ℃冰箱中保存。

2.5 HE 染色观察肺组织形态 取于4%多聚甲醛中固定的肺组织，经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片（5 μm），苏木精染色，乙醇伊红复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，在光学显微镜下观察拍照。参考文献［10］ 报道对肺组织损伤进行评分，正常肺组织为0 分； 轻度炎症现象为1 分； 肺泡壁结构无明显破坏，出现中度炎症改变为2 分； 肺泡壁增厚，中度炎症损伤为3 分；肺组织结构区域性破坏，中至重度炎症损伤为4 分；肺组织破坏布满整个视野，重度炎症损伤为5 分。

2.6 ELISA 法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平 严格按照ELISA 试剂盒说明书检测小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平。

2.7 流式细胞仪检测腹主动脉血CD4＋、CD8＋T 细胞比例 取各组小鼠血液，加入CD4-PE、CD8-FITC 抗体，黑暗环境下反应30 min，离心后重悬，置于流式细胞仪中，上机检测CD4＋、CD8＋T 细胞比例。

2.8 Western blot 法检测肺组织TLR4、NF-κB 蛋白表达 取于-80 ℃冰箱保存的小鼠肺组织约30 mg，添加蛋白裂解液后冰上裂解20 min，4 ℃、10 000 r/min 离心20 min，BCA 试剂盒测定蛋白总浓度，每孔上样30 μg，电泳分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，加入对应一抗TLR4 （1 ∶1 000）、NF-κB （1 ∶1 000）、GAPDH （1 ∶2 000），4 ℃孵育过夜，次日加入二抗（1 ∶4 000），室温孵育1 h，二氨基联苯胺显色试剂显色，蛋白凝胶成像仪拍照。

2.9 统计学分析 通过SPSS 25.0 软件进行处理，符合正态分布、方差齐的计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 复方百部止咳糖浆对小鼠一般状况的影响 对照组小鼠精神状态良好、运动活泼，皮毛光亮，饮食饮水正常； 模型组小鼠精神较差，反应迟钝，皮毛凌乱缺乏光泽，食量下降； 阳性组小鼠精神状态良好，运动、饮食增加； 复方百部止咳糖浆各剂量组小鼠精神状态逐渐好转，运动、饮食增加。

3.2 复方百部止咳糖浆对小鼠菌落数量及肺组织形态的影响 除对照组外，其余各组小鼠均检测到百日咳杆菌，见图1。对照组肺泡间隔无增厚； 模型组肺组织肺泡受损明显，出现异常的肺泡结构、明显的炎症浸润，肺泡增厚和弥漫性间充质水肿明显； 阳性组肺组织损伤不明显，出现一定的炎症浸润、水肿； 复方百部止咳糖浆各剂量组随着剂量的增加，肺组织肺泡结构逐渐正常，炎症浸润明显缓解，水肿减轻，肺泡间隔增厚减弱，见图2。与对照组比较，模型组菌落数量、肺组织损伤评分升高（P＜0.05）； 与模型组比较，复方百部止咳糖浆各剂量组菌落数量、肺组织损伤评分降低 （P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与阳性组比较，复方百部止咳糖浆低、中剂量组菌落数量、肺组织损伤评分升高（P＜0.05），高剂量组菌落数量、肺组织损伤评分降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠菌落数量、肺组织损伤评分比较（±s，n＝12）Tab.1 Comparison of colony number and pulmonary tissue injury score in mice of each group （±s，n＝12）

表1 各组小鼠菌落数量、肺组织损伤评分比较（±s，n＝12）Tab.1 Comparison of colony number and pulmonary tissue injury score in mice of each group （±s，n＝12）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与阳性组比较，△P＜0.05。

组别菌落数量/个肺组织损伤评分/分对照组0.00±0.000.00±0.00模型组404.42±32.72*3.95±0.36*阳性组204.42±22.48＃2.16±0.23＃复方百部止咳糖浆低剂量组 343.50±25.43＃△3.15±0.32＃△复方百部止咳糖浆中剂量组 262.17±26.62＃△2.57±0.27＃△复方百部止咳糖浆高剂量组87.42±14.34＃△1.86±0.19＃△

图1 各组菌落观察Fig.1 Observation of colonies in each group

图2 各组小鼠肺组织形态学（HE 染色，×200）Fig.2 Mouse pulmonary tissue morphology of each group （HE staining，×200）

3.3 复方百部止咳糖浆对小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，复方百部止咳糖浆各剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与阳性组比较，复方百部止咳糖浆低、中剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P＜0.05），高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比较（pg/mL，±s，n＝12）Tab.2 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 levels in mice of each group （pg/mL，±s，n＝12）

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比较（pg/mL，±s，n＝12）Tab.2 Comparison of serum TNF-α，IL-1β and IL-6 levels in mice of each group （pg/mL，±s，n＝12）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与阳性组比较，△P＜0.05。

组别TNF-αIL-1βIL-6对照组562.12±73.46645.13±43.1656.16±7.48模型组1 023.13±143.16*2 338.16±534.45*186.15±16.35*阳性组737.86±68.47＃1 286.47±268.86＃113.24±11.34＃复方百部止咳糖浆低剂量组865.12±96.15＃△1 756.37±447.81＃△154.48±13.47＃△复方百部止咳糖浆中剂量组793.23±73.42＃△1 568.66±346.19＃△132.44±13.03＃△复方百部止咳糖浆高剂量组647.58±64.73＃△1 067.76±247.77＃△86.48±9.15＃△

3.4 复方百部止咳糖浆对小鼠腹主动脉血CD4＋、CD8＋T 细胞比例的影响 与对照组比较，模型组小鼠腹主动脉血CD4＋T 细胞比例降低（P＜0.05），CD8＋T 细胞比例升高（P＜0.05）； 与模型组比较，复方百部止咳糖浆各剂量组小鼠腹主动脉血CD4＋T细胞比例升高（P＜0.05），CD8＋T 细胞比例降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与阳性组比较，复方百部止咳糖浆低、中剂量组小鼠腹主动脉血CD4＋T 细胞比例降低（P＜0.05），CD8＋T 细胞比例升高（P＜0.05），高剂量组小鼠腹主动脉血CD4＋T细胞比例升高（P＜0.05），CD8＋T 细胞比例降低（P＜0.05），见图3、表3。

表3 各组小鼠腹主动脉血CD4＋、CD8＋T 细胞比例比较（±s，n＝12）Tab.3 Comparison of blood CD4＋and CD8＋T cell ratios in mouse abdominal aorta of each group （±s，n＝12）

表3 各组小鼠腹主动脉血CD4＋、CD8＋T 细胞比例比较（±s，n＝12）Tab.3 Comparison of blood CD4＋and CD8＋T cell ratios in mouse abdominal aorta of each group （±s，n＝12）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与阳性组比较，△P＜0.05。

组别CD4＋T 细胞比例/%CD8＋T 细胞比例/%对照组38.45±1.9820.97±0.95模型组27.91±0.81*31.15±1.59*阳性组32.94±1.36＃23.98±1.05＃复方百部止咳糖浆低剂量组29.89±1.03＃△27.53±1.30＃△复方百部止咳糖浆中剂量组31.79±1.24＃△25.49±1.17＃△复方百部止咳糖浆高剂量组34.63±1.45＃△22.17±1.01＃△

3.5 复方百部止咳糖浆对小鼠肺组织TLR4、NFκB 蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，复方百部止咳糖浆各剂量组小鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白表达降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与阳性组比较，复方百部止咳糖浆低、中剂量组小鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白表达升高（P＜0.05），高剂量组肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05），见图4、表4。

表4 各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白表达比较（±s，n＝12）Tab.4 Comparison of pulmonary tissue TLR4 and NF-κB protein expressions in mice of each group （±s，n＝12）

表4 各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白表达比较（±s，n＝12）Tab.4 Comparison of pulmonary tissue TLR4 and NF-κB protein expressions in mice of each group （±s，n＝12）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与阳性组比较，△P＜0.05。

组别TLR4/GAPDHNF-κB/GAPDH对照组0.16±0.030.34±0.05模型组0.86±0.09*1.57±0.18*阳性组0.34±0.05＃0.70±0.06＃复方百部止咳糖浆低剂量组0.67±0.06＃△1.40±0.16＃△复方百部止咳糖浆中剂量组0.51±0.06＃△1.12±0.13＃△复方百部止咳糖浆高剂量组0.23±0.03＃△0.47±0.06＃△

图4 各组小鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白条带Fig.4 Protein bands of pulmonary tissue TLR4 and NF-κB in mice of each group

4 讨论

目前，接种百白破疫苗可有效降低百日咳杆菌感染，但不能获得终身性免疫［11-12］，导致百日咳发病率回升，研究百日咳的有效治疗方法对于缓解疾病意义重大。本研究采用Tohama Ⅰ株感染7 d 建立百日咳小鼠呼吸道感染模型，经鉴定，模型小鼠均检出百日咳杆菌，且均表现为耸毛、精神萎靡、易受惊状态，与高晶晶等［8］研究一致，证明模型建立成功。

百日咳病因在本虚标实，治疗除“祛邪” 外，还应重视“扶正”。祛邪主要指清热化痰，调肝降逆； 扶正表现为泻肺祛邪时兼润肺［3］。复方百部止咳糖浆中百部润肺下气、止咳； 苦杏仁止咳平喘、润肠通便； 桑白皮泻肺平喘、利水消肿； 麦冬养阴生津、润肺清心； 知母清热、镇咳； 黄芩清热燥湿、泻火解毒； 陈皮健脾燥湿化痰、化寒痰； 甘草益气复脉、镇咳平喘； 天南星燥湿化痰、祛风止痉； 枳壳利尿、镇静、行气化瘀； 桔梗止咳祛痰、宣肺利咽，全方诸药相合，具有宣肺止咳、平喘化痰功效［13-14］。本研究以4 周龄小鼠为研究对象，模拟4～5 岁儿童［15］，发现复方百部止咳糖浆可以在一定程度上减少小鼠百日咳细菌数量和肺组织损伤评分，并改善百日咳小鼠肺组织肺泡结构和炎症浸润，减轻水肿和肺泡间隔增厚现象，且呈剂量依赖性。提示复方百部止咳糖浆可以在一定程度上改善百日咳小鼠疾病状况，缓解肺组织损伤情况，实现对百日咳的治疗作用。

TLR4 参与炎症反应与免疫应答调节模式识别受体，细菌、病毒刺激后病原模式分子能被TLR4识别，从而诱发TLR4 活化，活化的TLR4 通过多种途径促进NF-κB 活化，从而调控基因的表达［16］。而NF-κB 作为核转录因子，位于TLR4 下游，正常情况下与抑制蛋白结合没有活性［17］； 在细胞受到刺激时，NF-κB 与抑制蛋白分离而被活化，活化后的NF-κB 进入细胞核，与靶基因上特定的κB 序列结合，启动核内相关因子的表达，进而促进下游炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 的表达［18-19］。TLR4可进一步调节T 细胞免疫，增强免疫活性，放大炎症效应，从而发挥作用［20］。在机体免疫过程中，CD4＋起辅助作用，CD8＋起免疫抑制作用，二者相互拮抗。研究显示百日咳患儿的外周血中CD4＋水平降低，CD8＋水平升高，二者比例明显失调［21］，本研究结果与其一致，说明百日咳小鼠的免疫反应过度。经复方百部止咳糖浆干预后，小鼠血清TNFα、IL-1β、IL-6 水平、腹主动脉血CD8＋T 细胞比例、肺组织TLR4、NF-κB 蛋白表达均降低，腹主动脉血CD4＋T 细胞比例升高，表明复方百部止咳糖浆可能通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路降低炎症因子的表达，缓解免疫过度激活，发挥抗炎作用。

综上所述，复方百部止咳糖浆可能通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路从而降低炎症因子的表达，缓解过度免疫反应，起到抗炎作用，从而实现对机体的保护，为百日咳的临床治疗提供理论依据。