冬虫夏草蛋白质提取工艺、分析鉴定及药理作用研究进展

唐楚煜，李秀璋，2，王 涛，陈建博，梁 静，李玉玲，2*

（1.青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016； 2.青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016）

冬虫夏草Chinese cordyceps 是一种长期分布在高寒草甸地带阴坡或半阴半阳坡的特殊药用真菌，相较于其他虫草属真菌，天然冬虫夏草由于其地理分布的严苛和寄主蝠蛾生境的特殊，所以资源稀缺且价格昂贵［1］。真菌蛋白质作为天然冬虫夏草的主要活性成分之一，是从丝状真菌中提取的一种富含矿物质、维生素、人体必需氨基酸的物质，具有独特的结构和丰富的营养价值［2］。近年来，对冬虫夏草蛋白质的研究逐渐深入，发现虫草蛋白除对机体具有提高免疫及抗肿瘤的功效外，也具备作为冬虫夏草质量鉴定的关键活性成分的潜力［3-4］。因此，在天然冬虫夏草资源极其有限的情况下，寻找一套简便有效的工艺提取及鉴定方法是研究冬虫夏草蛋白的关键。此外，对冬虫夏草蛋白药理活性的深入研究也为冬虫夏草的进一步开发利用提供理论支持。

1 概述

冬虫夏草是由麦角菌科真菌冬虫夏草菌（Ophiocordyceps sinensis） 侵染鳞翅目蝙蝠蛾科（Hepialidae） 幼虫后形成的真菌子座和充满菌丝体的僵死幼虫复合体［5-6］。在我国，天然冬虫夏草主要分布在3 000 m 以上的高海拔地区，位于西藏、青海、四川等地的高寒灌丛或草甸草原［7-8］，其体内含有的甾醇、虫草多糖、蛋白质等化学成分和营养物质与其他虫草品种有所差异，对人体的机能恢复及疾病防御有更高效的作用。据报道，冬虫夏草对于改善呼吸系统和治疗肝脏、心血管、慢性肾脏疾病有较好效果，同时还具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、美白等功效［9-11］。

冬虫夏草蛋白质作为给机体提供能量及增强免疫的源头，每一根冬虫夏草中约含20.06% ～26.40% 的粗蛋白，是冬虫夏草中含量最高的活性成分［12］。童芯锌等［13］发现，正品天然冬虫夏草中共同表达的蛋白斑点有88 个，分别来自菌数据库（6 个）、昆虫数据库（9 个）、全库（12 个）等，提示功能性蛋白大多为低丰度蛋白。这些蛋白通常由天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸等19 种氨基酸组成，其中谷氨酸、酪氨酸和色氨酸为天然冬虫夏草的主要成分，色氨酸为主要的有效成分［12］。李文庆等［14］发现通过不同加工方式处理冬虫夏草后氨基酸的种类未发生改变，但随温度增高游离氨基酸含量明显下降，见表1。张晗星等［15-16］研究发现，冬虫夏草在“由虫至草” 的转换过程中，虫体、子实体及从寄主幼虫至僵虫过渡的进程中均有不同蛋白的形成和改变，其体内蛋白的变化存在寄主幼虫蛋白向真菌蛋白发育过渡的聚类关系。在药理研究方面，冬虫夏草蛋白质具有抗氧化［17］、抗炎症［18-19］、DNAase 活性［17］、抑制身体肥胖［20］等更多的功效，是保证机体健康和提供能量的基础［21］。

表1 不同加工方式下冬虫夏草氨基酸组成、含量（±s）

表1 不同加工方式下冬虫夏草氨基酸组成、含量（±s）

注： 同行肩标不同小写字母表示差异极显著（P＜0.01）。

游离氨基酸鲜冬虫夏草/%晒干冬虫夏草/%烘干冬虫夏草/%类型天冬氨酸0.45±0.0220.26±0.0210.32±0.010药效氨基酸、呈味氨基酸谷氨酸1.11±0.3170.47±0.0300.53±0.052药效氨基酸、呈味氨基酸天冬酰胺0.18±0.0190.15±0.0070.16±0.006—丝氨酸0.34±0.0080.18±0.0100.19±0.015呈味氨基酸谷氨酰胺0.49±0.3670.80±0.0430.63±0.053—甘氨酸0.22±0.0020.11±0.0090.11±0.007药效氨基酸、呈味氨基酸组氨酸0.32±0.0070.18±0.0070.15±0.010呈味氨基酸精氨酸0.62±0.0230.39±0.0190.37±0.029药效氨基酸、呈味氨基酸苏氨酸0.33±0.01images/BZ_190_734_860_734_875.png60.19±0.0120.19±0.014呈味氨基酸、必需氨基酸丙氨酸0.53±0.0260.35±0.0380.39±0.019呈味氨基酸脯氨酸0.31±0.0130.21±0.0110.24±0.020—酪氨酸0.13±0.0080.16±0.0070.17±0.009药效氨基酸缬氨酸0.36±0.0110.21±0.0180.21±0.013呈味氨基酸、必需氨基酸甲硫氨酸0.11±0.0030.05±0.0030.06±0.003药效氨基酸、呈味氨基酸、必需氨基酸异亮氨酸0.26±0.0090.14±0.0070.15±0.010呈味氨基酸、必需氨基酸亮氨酸0.50±0.0130.29±0.0180.30±0.017药效氨基酸、呈味氨基酸、必需氨基酸苯丙氨酸0.34±0.0090.22±0.0110.21±0.010药效氨基酸、呈味氨基酸、必需氨基酸色氨酸0.08±0.0020.04±0.0010.05±0.003呈味氨基酸、必需氨基酸赖氨酸0.26±0.0040.17±0.0090.14±0.008药效氨基酸、必需氨基酸总量7.06±0.271a4.55±0.236b4.57±0.228b—

2 提取工艺

随着后基因组技术的不断发展，蛋白质组学成为药用真菌研究的主要技术［22］。通过蛋白水平对药用真菌的药理机制进行研究成为趋势，因此，获得高纯度的目的蛋白是对该真菌质量评定的重要步骤，也可为进一步的分离纯化及分析鉴定提供优质原材料［23］。

2.1 物理提取 为稳定蛋白质和多肽的结构一般使用Tris-HCl 提取液提取真菌蛋白［23］，而不溶于稀盐、酸、碱的蛋白即与脂类结合的少数蛋白则选用TCA-丙酮溶液、乙醇、异丙酮等有机溶液提取［24］。由于低丰度蛋白的等电点及pH 值与其他蛋白存在差异，用酸、碱法提取往往能获得更高的提取率［25-26］。研究发现，亚临界水萃取技术（SWE）具备高渗透和高传质能力，可替代有机溶剂从天然基质中萃取弱极性物质，大大提高萃取蛋白的能力［27］。杨文雅等［28］利用SWE 技术对蛹虫草蛋白进行提取，在萃取温度140 ℃、萃取时间20 min、液料比40 ∶1、萃取pH 值8 时，蛋白得率达33.25%，能有效解决传统技术提取蛋白时溶出率低的问题，表明该技术相较于传统热水浸提法更环保。

由于真菌细胞壁通常是由蛋白质、葡聚糖、甘露聚糖等成分交织形成的坚韧、不易破碎的结构，会导致胞内蛋白难以释放且提取相对困难［23］。因此，除试剂提取外还有超声波法、液氮冷冻研磨法、玻璃珠法来进行蛋白的提取［29］。其中超声波不同于光、电，在传播过程中可使介质的结构或形态发生改变，所以在部分食品及蛋白质的提取过程中使用超声提取能在一定程度上加快化学反应，进而提高提取效率［30］。使用超声对真菌蛋白的提取率略高于回流提取［31-33］。才凤等［32］采用超声提取工艺运用单因素和正交实验优化冬虫夏草蛋白质提取方法，发现最佳条件为0.02 mol/L 溶剂，pH 值7.4，PBS 缓冲液料液比1 ∶50，提取时间15 min。

2.2 酶提取 酶解法是利用酶的专一性，通过裂解生物细胞壁或消溶该酶类作用对象得到胞内物质的方法，一般提前选择与该蛋白相对应的酶进行提取［34］。利用酶解法进行蛋白提取时有单酶解和双酶解两种方式，常选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶［35］。宗静［34］在提取蛹虫草活性多肽时发现，双酶解法的提取率明显高于水提醇沉法，此外，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶的双酶解法对多肽的提取率明显高于单酶解法，且在底物浓度为6%，加酶量为2.5%，温度为42 ℃，时间为8 h 时，多肽提取率最高。相较于其他提取方法，双酶解法具有反应条件温和、提取时间短等优势，但不足之处是提取过程中酶易停留在提取液中，蛋白质的降解也促使其得率下降且成本相对高［36］。综上所述，冬虫夏草蛋白提取的报道较少，故可与其他真菌蛋白的提取工艺相互借鉴。此外，真菌胞内蛋白进行提取时通常选用有机溶剂和复合超声波提取，利用正交实验和响应面法来优化参数得到最优提取工艺。相较于直接使用有机溶液或水进行提取，选用超声波辅助提取能使细胞破碎更快并缩短时间，从而提高蛋白得率，因此，使用物理与化学相结合的方法能在一定程度上提高蛋白质提取率并降低损失率，得到相对理想结果。见表2。

表2 不同提取方法下真菌蛋白得率

3 分析鉴定

3.1 分离纯化 蛋白质提取完成后一般将大分子混合物分离纯化后再进行分析鉴定，通常根据蛋白质的溶解度、分子量、带电量、吸附程度等性质选择盐析法、超滤法、凝胶色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、高效液相色谱法等方法进行分离纯化［34］。任艳［3］选用超滤分离法和葡聚糖凝胶柱层析法分别对冬虫夏草蛋白进行分离纯化，初步分离发现，在1 个柱体积的洗脱时间内，冬虫夏草的5 个蛋白峰基本得到分离，对该蛋白组分的免疫活性进行研究后发现，其对巨噬细胞分泌因子IL-1、IL-12 等具有双向调节的免疫作用。由于在分离纯化过程中，分子伴侣、结合蛋白、折叠酶等维持正常的蛋白质稳态的小分子蛋白容易发生改变，所以在分离纯化前将冬虫夏草蛋白低温保存是防止蛋白含量降低的关键。

3.2 定量定性分析 对蛋白质含量、分子量、纯度、氨基酸组成、蛋白结构的分析测定是深入了解该蛋白的必要过程。基于分析方法原理，蛋白质的分析方法通常分为2 个方面，一方面是根据其共性如肽链、肽键、含氮量等利用凯氏定氮法、双缩脲法、电泳法等方法对蛋白质含量进行测定； 另一方面是使用福林酚试剂等测定蛋白质中氨基酸残基、酸碱性基团等。此外，生物检定法、免疫学方法、色谱分析、质谱分析、电泳法等也是蛋白质定量定性分析中常用的方法［34，36-38］。

3.2.1 含量分析 化学分析法、色谱法、光谱法是蛋白含量测定过程中较常用的3 种方法［39］。在真菌蛋白检测中常采用化学分析法，如二辛可宁酸法（BCA 法）、考马斯亮蓝法（Bradford 法）、福林-酚试剂法（Lowry 法）、色谱法中的毛细管电泳法［40］。BCA 法通常使用试剂盒测定总蛋白，其提取溶剂对蛋白提取效果有很大的影响，因此在反映蛋白质含量和对其进行定量跟踪方面均有困难。Lowry 法为化学显色法，在测定过程中可能因虫草内色素物质以及化学物质产生反应，不宜进行准确测定，且其对时间精准度的要求较严格。Bradford 法在测定时由于操作误差小且精密度较高，相较于Lowry 法的Tris 缓冲液、乙二胺四乙酸（EDTA） 等干扰因素，Bradford 法不存在试验干扰，因此常用于对冬虫夏草蛋白质含量进行测定［41］。任艳［3］分别使用BCA 法、Bradford 法、Lowry 法对冬虫夏草可溶性蛋白质含量进行测定，对比发现，相对于其他2 种方法，Bradford 法对冬虫夏草蛋白提取物、上样蛋白液含量同组间有重现性好的优势，且该法对蛋白质含量的影响较小、误差率较低，但由于不同蛋白质所含精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，使用Bradford 法可能会产生不同程度的偏差。冷平等［41］研究发现，凝胶染色扫描法能有效提高冬虫夏草蛋白含量测定的精密度和重复性，在一定程度上弥补了Bradford 法的不足，为蛋白质的测定提供新思路。

3.2.2 分子量及纯度分析 电泳法作为冬虫夏草及其他真菌蛋白纯度和定量分析的最常用的方法之一，具有重现性好的优点，在多肽及低丰度小分子蛋白的定量分析中具有重要意义。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE） 是蛋白质分子量测定和纯度鉴定的常用方法，它是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳技术［9］。在运用SDS-PAGE 电泳对蛋白质进行分离时，可根据蛋白质的相对分子量对凝胶的种类和孔径进行调整，从而将不同蛋白质分离，再对其相对分子量进行检测评估，该方法相较于层析、琼脂糖凝胶电泳等分离技术操作更简便且分辨率高［21］。而双向凝胶电泳技术（2-DE） 是利用蛋白质的等电点和相对分子质量的差异性在分离过程中通过等电聚焦电泳（IEF） 和SDS-PAGE 电泳进行2 个方向的分离，可将表达丰度差异较大的蛋白进行分析，并能对低丰度蛋白质进行检测，因此，该技术是目前最高效、分辨率高的复杂蛋白质组分分离技术［9］。

SDS-PAGE 电泳和2-DE 电泳技术已被广泛使用于真菌蛋白的组分定量分析中［42-43］。李春红［21］通过SDS-PAGE 电泳得出不同产地虫草蛋白条带数量和光密度曲线基本相似，2-DE 电泳进一步分析发现不同产地冬虫夏草蛋白个数和丰度均存在显著差异，表明天然冬虫夏草的可溶性蛋白组分与其来源有一定的关联。Li 等［44］通过SDS-PAGE 电泳和2-DE 电泳对产地为青海、四川、西藏的26 批天然冬虫夏草中的蛋白质多样性进行分析，发现不同产区的冬虫夏草蛋白条带存在差异且蛋白质斑点数量和丰度也不同，通过层次聚类分析发现蛋白斑点与产地有一定关系。此外，石继红等［45］采用SDS-PAGE 电泳和高效液相色谱（HPLC） 法对冬虫夏草菌丝体蛋白与天然冬虫夏草蛋白成分进行分析，发现冬虫夏草菌丝体所含水溶性蛋白较天然冬虫夏草的水溶性蛋白组成简单且分离效果好。综上所述，SDS-PAGE 电泳和2-DE 电泳作为经典的蛋白质组分分析方法具有高分辨率、重现性好等特点，常用于冬虫夏草等名贵中药材蛋白质的分析并在活性蛋白研究中发挥重要作用［46-47］。

3.2.3 氨基酸组成分析 氨基酸组分分析能更直观地展现成分含量及蛋白构成，因此常利用氨基酸自动分析仪，以外标法对氨基酸含量进行测定。严冬等［48］运用氨基酸自动分析仪测定西藏不同产地冬虫夏草氨基酸的种类和含量，并进行营养评价，研究发现，西藏各产地冬虫夏草均有19种氨基酸且药效氨基酸约占总氨基酸量的56%。杨大荣等［49］对虫草蝙蝠蛾和云南冬虫夏草氨基酸进行分析，发现蝙蝠蛾幼虫的氨基酸含量对于整株冬虫夏草的氨基酸含量起着主导作用。相较于蛋白质分析，氨基酸分析能更直观清晰且快速地测定蛋白的氨基酸组成，对后期的营养分析及成分药理研究具有重要意义。但在测定过程中若存在杂蛋白将很大程度影响测定结果，因此在实验过程中需结合其他方法进行进一步分析鉴定。

4 药理作用

冬虫夏草是我国珍贵的滋补肾肺的中药材，《本草从新》 中指出其具有益肾、止喘、保肺等功效，近年国内外的实验研究中证实冬虫夏草可提高机体的免疫功能、对缺氧及血栓性疾病等都有重要作用［3］。其中冬虫夏草蛋白的药理研究较少，但蛋白质作为构成细胞的基础，对机体的生存及各种活动及联系至关重要，因此虫草蛋白的作用不容小觑。

4.1 抗衰老、抗氧化 超氧化物歧化酶（SOD） 是存在于植物、动物、微生物体内的一种抗氧化金属酶，是生物体系中抗氧化酶系的重要组成部分，在生物体内氧化与抗氧化的动态平衡中起着重要作用。《中药大辞典》 中记载冬虫夏草具有抗衰老、抗氧化的功效，其主要发挥作用的活性成分就是一种特殊的活性蛋白——超氧化物歧化酶［50］。肖瑛等［51］发现，鲜冬虫夏草中存在能够清除自由基及抑制自由基产生的SOD 酶，通过超氧阴离子、羟自由基及DPPH自由基清除实验证实，鲜冬虫夏草水提物中具备清理机体内有害物质的能力和抗氧化的作用。Cheng 等［52］发现，冬虫夏草提取液可逆转D-半乳糖胺/脂多糖诱导的肝衰竭，该提取液可使雄性小鼠SOD 活性升高，提高小鼠的抗衰能力，通过TUNEL 法等检测发现冬虫夏草提取液对肝细胞的凋亡有抑制作用。此外，孙祥环等［53］同样发现，冬虫夏草营养液具有抑制大鼠肝匀浆脂质过氧化的功能，并证实发酵冬虫夏草营养液具有抗衰老作用。

4.2 抗血栓 血栓性疾病是通过血栓形成和血栓栓塞两种病理过程所引起的疾病，发病率较高且严重威胁生命健康［54］。臧琬婷等［55］从冬虫夏草菌丝中发现了至少2 种纤溶酶，分别命名为OSP-1、OSP-2，其中OSP-1 作为酸性丝氨酸蛋白酶可依次水解纤维蛋白原中的γ、Aα、Bβ 链，研究表明该蛋白酶不不仅具备较高的纤溶酶活性，还可能具备激活纤维蛋白溶酶原的作用。研究发现，纤溶酶在不少菌物药中普遍存在，其活性在pH、金属离子等因素影响下发挥不同作用，从冬虫夏草菌丝中提取的纤溶酶相较于蛹虫草及其他真菌具有更广的纤溶范围，同时具有水解γ、Aα、Bβ 三条链的独特优势，对真菌纤溶酶应用于临床具有重要意义，也为开发新型溶栓药物提供新思路［55-56］。

4.3 免疫调节 冬虫夏草蛋白质在免疫调节中具有重要作用［57］，如从高等担子菌子实体中提取的真菌免疫调节蛋白（FIPs） 和凝集素等。凝集素是一种非免疫起源的蛋白或糖蛋白，而FIPs 是一种免疫功能与凝集素相似的小分子蛋白，两者都具有相似的免疫调控、抗病毒、抗肿瘤等药理功能，在植物体内的防御及代谢过程中扮演着重要角色［58］。随着真菌蛋白免疫功能的深入研究，He 等［59］在冬虫夏草分离过程中发现并命名了一种新型多糖蛋白——HS002-Ⅱ，内含42.1% 蛋白质、57.9% 多糖，通过对小鼠巨噬细胞RAW264.7 中一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α） 等细胞因子水平检测后发现，HS002-Ⅱ具有免疫调节活性，可作为潜在的免疫调节源进行开发。王玉贤等［60］研究发现，冬虫夏草蛋白提取物同样具有免疫调节功能，通过ELISA 试剂盒检测表明，冬虫夏草蛋白提取物可以促进正常巨噬细胞分泌TNF-α、白细胞介素-1 （IL-1）、白细胞介素-12 （IL-12），并能抑制肺癌细胞A549 的增殖。此外，从冬虫夏草中提取的多球壳菌素能抑制高浓度葡萄糖诱导的G1/S-特异性周期蛋白-D1 （cyclin D1） 表达升高，使cyclin D1 正常表达［6］。

4.4 其他 冬虫夏草的活性成分除了虫草多糖、虫草腺苷、虫草蛋白外，还有多种肽类物质，例如cycloaspeptides F～G［61］、cordyceamides A ～B 等蛋白多肽［62］。研究发现，从冬虫夏草培养液中分离的一种环二肽cordycedipeptide A，对L-929、A375、HeLa 细胞均具有细胞毒活性［6］。此外，氨基酸和部分多肽具备治疗高血压、失眠、记忆、食欲不佳及调节情绪等功能，其中色氨酸作为血清素前体，对情绪及睡眠都有一定的舒缓及调节作用［63］。

5 结语

由于冬虫夏草特殊的生长环境和相对严苛的保存条件，其活性成分的研究十分有限［64］。近年来，冬虫夏草的研究集中在活性成分的粗提、冬虫夏草菌菌丝体的发酵和冬虫夏草寄主昆虫等［65］。为了缓解天然冬虫夏草资源短缺，目前已利用深层发酵技术获得与天然冬虫夏草药用价值相当的冬虫夏草发酵菌丝体，并成功制成“百令胶囊” 等相关产品［7］。

冬虫夏草作为我国珍贵的药用虫生真菌，因其多成分多功效受到众多关注。冬虫夏草蛋白质的研究集中于提取、分离纯化、鉴定、含量测定方面，超声波辅助提取［33］、凝胶色谱法纯化［3］、Bradford 法含量测定［40］、SDS-PAGE 电泳、2-DE 电泳为冬虫夏草蛋白提取分析的最佳组合［21］，冬虫夏草蛋白质具有抗氧化、抗血栓、免疫调节等作用。

目前，对冬虫夏草蛋白质的研究多停留在粗提物，其功能性多肽的分离鉴定及药理作用的研究鲜有报道，冬虫夏草蛋白质药理作用研究有着巨大潜力［60］。利用特征多肽或蛋白作为指标成分对冬虫夏草进行真伪鉴定或质量评价，亦或是新型冬虫夏草蛋白类药物开发，都需要对冬虫夏草蛋白质或虫草多肽进行更深入的研究。此外，冬虫夏草蛋白质的合成过程及代谢途径未有报道，有待进一步研究。建立科学的、系统的冬虫夏草蛋白质提取、分离纯化、鉴定体系，并对蛋白合成途径和结构深入分析是未来冬虫夏草蛋白质的研究重点。