金丝桃苷纳米结构脂质载体制备及其体内药动学研究

张艳慧，董亚娜，谈秀凤

（1.黄河科技学院，河南 郑州 450063； 2.上海中医药大学，上海 201203）

金丝桃苷是普遍存在于金丝桃科、藤黄科、桔梗科、杜鹃花科、豆科植物中的一种黄酮醇苷类化合物［1］，具有抑制痛经、抗抑郁、抗炎、心脑血管保护、抗血栓、抗急性肝损伤等作用［1］，并且在妇科肿瘤方面中的应用也较多，可用于治疗卵巢功能不全、卵巢癌、子宫癌等［1-3］，但其水溶性差［4］，体外溶出度低［5］，口服吸收生物利用度仅为10%左右［6］，导致药理作用无法充分发挥。前期报道，Feng 等［7］制备了金丝桃苷脂质体，但工艺复杂； Shen 等［8］制备了金丝桃苷纳米混悬剂，但粒径达384 nm，可能会限制其生物利用度提高程度［9］。

纳米结构脂质载体具有较高的包封率、载药量，可有效提高生物利用度、药效［10-13］，是制剂学领域研究的热门技术之一。因此，本实验制备金丝桃苷纳米结构脂质载体，并考察其体内药动学，以期为相关制剂学研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 BSA224S 型电子天平（德国Sartorius 公司）；Agilent 1200 型高效液相色谱仪，配置DAD 检测器、温控进样盘（美国Agilent 公司）； JP-060S 型超声仪（深圳市明望科技有限公司）； Alpha 1-4 型真空冷冻干燥机（北京博劢行仪器有限公司）； Nano-ZS90 型粒度分析仪 （英国Malvern Panalytical 仪器有限公司）； HJ-4A 型恒温磁力搅拌器（常州市凯航仪器有限公司）； D-37520 型高速离心机（德国Kendro 仪器公司）； UGC-12M 型氮气吹扫仪（北京优晟联合科技有限公司）。

1.2 试剂与药物 金丝桃苷原料药（批号20190719，纯度＞90%，杭州甫洛生物科技有限公司）； 金丝桃苷对照品（批号111521-1909，纯度95.4%，中国食品药品检定研究院）； 山嵛酸甘油酯对照品（批号20190225，国药集团化学试剂有限公司）； 乙酰苯胺对照品（批号202004-1，纯度98.2%，南京森贝伽生物科技有限公司）。Miglyol ®812 （批号20180708，北京凤礼精求医药股份有限公司）； 泊洛沙姆188 （批号181118，武汉兴起点生物科技有限公司）； 超滤离心管（截留分子量8 000～14 000 Da，美国Pall 公司）。

1.3 动物 SD 大鼠，体质量240～270 g，购于河南省实验动物中心，动物生产许可证号SCXK （豫） 2016-0001。

2 方法与结果

2.1 纳米结构脂质载体制备 取金丝桃苷原料药50 mg 及处方量山嵛酸甘油酯、液体脂质Miglyol ®812，置于烧瓶中，加入10 mL 甲醇，70 ℃水浴加热溶解，作为有机相；蒸馏水配制50 mL 泊洛沙姆188 溶液，70 ℃水浴加热溶解，作为水相，在900 r/min 搅拌速度下将有机相滴加至水相中，持续搅拌2 h 以除尽有机溶剂，设置超声功率为1 138 W的30%，超声时间为20 min，置于-18 ℃冰箱中固化8 min，0.45 μm 微孔滤膜过滤，续滤液加蒸馏水至50 mL，即得。

2.2 金丝桃苷含量测定 采用HPLC 法。

2.2.1 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）； 流动相乙腈-0.1% 磷酸（20 ∶80）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长360 nm。

2.2.2 线性关系考察 取金丝桃苷对照品10 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得200 μg/mL 贮备液，流动相依次稀释至40.0、20.0、5.0、1.0、0.1、0.05 μg/mL，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积 （Y） 对质量浓度 （X） 进行回归，得方程为Y＝16.341 8X＋0.627 5 （r＝0.999 6），在0.05～40.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.3 供试品溶液制备 取纳米结构脂质载体混悬液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加8 mL 甲醇超声处理以破坏其结构，流动相定容至刻度，取1 mL 至10 mL 量瓶中，流动相定容至刻度，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 方法学考察 取纳米结构脂质载体混悬液1 mL，按“2.2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得金丝桃苷含量RSD为1.41%，表明该方法重复性良好。取供试品溶液适量，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得金丝桃苷含量RSD 为0.45%，表明仪器精密度良好。取供试品溶液适量，于0、4、8、12、16、24 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得金丝桃苷含量RSD 为1.07%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。取纳米结构脂质载体混悬液1 mL，共9 份，置于9 个10 mL 量瓶中，分成低、中、高3 组，分别加入200 μg/mL 贮备液0.8、1.2、1.6 mL，加8 mL 甲醇超声处理以破坏其结构，按“2.2.3” 项下方法制备份供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得金丝桃苷平均加样回收率分别为100.67%、98.96%、100.09%，RSD 分别为1.82%、1.53%、1.46%。

2.3 包封率、载药量测定 先计算金丝桃苷总含量（m总）。再取纳米结构脂质载体混悬液1 mL，置于超滤管（截留分子量8 000 ～14 000 Da） 中，设置转速为10 000 r/min，温度为4 ℃，时间为30 min，取续滤液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算游离药量（m游离）。包封率、载药量计算公式分别为载药量＝ ［（m总-m游离） /（m总＋m纳米粒）］ ×100%、包封率＝ ［（m总-m游离） /m总］ ×100%，其中m纳米粒为纳米粒总质量。

2.4 粒径、Zeta 电位测定 取纳米结构脂质载体混悬液0.5 mL，蒸馏水稀释20 倍，取适量在粒度分析仪上测定粒径、多分散系数（PDI）、Zeta 电位。

2.5 处方优化 采用Box-Behnken 响应面法。

根据预实验结果，固定投药量50 mg，以固态脂质用量（X1）、液态脂质用量（X2）、表面活性剂（泊洛沙姆188） 浓度 （X3） 为影响因素，包封率 （Y1）、载药量（Y2）、粒径（Y3） 为评价指标，Box-Behnken 响应面法优化处方，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平

表2 试验设计与结果

表3 方差分析

响应面分析见图1。由此可知，在一定范围内固态脂质用量、液态脂质用量增加可使包封率升高，但随着前者用量增加载药量呈先升后降的趋势，而后者对其影响较复杂； 表面活性剂用量对包封率、载药量的影响均为先升后降； 随着固态脂质用量增加粒径呈现先降后升的趋势，而液态脂质用量对其影响不大； 随着表面活性剂增加粒径先降后升，并且液态脂质用量对其影响较小； 随着表面活性剂、固态脂质用量增加粒径先降后升。

图1 各因素响应面图

最终确定，最优处方为固态脂质用量1 015.59 mg，液态脂质用量269.41 mg，表面活性剂浓度1.12%，包封率为91.74%，载药量为3.48%，粒径为158.14 nm，为便于实际操作，将其修正为固态脂质用量1 015 mg，液态脂质用量270 mg，表面活性剂浓度1.1%。按优化处方平行制备3批样品（图2），测得平均包封率为89.92%，载药量为3.37%，粒径为162.56 nm （图3），后两者与预测值3.48%、158.14 nm 较接近，同时平均Zeta 电位为-34.28 mV （图4）。

图2 金丝桃苷纳米结构脂质载体外观

图3 金丝桃苷纳米结构脂质载体粒径分布

图4 金丝桃苷纳米结构脂质载体Zeta 电位

2.6 冻干粉制备 取纳米结构脂质载体混悬液适量，加入5%冻干保护剂甘露醇，振荡混匀，在-30 ℃下预冻3 d，置于冷冻干燥仪（冷阱值-50 ℃） 中，抽真空（0.1 MPa）1 d，即得 （图5）。经测定，其复溶后平均包封率为81.14%，平均粒径为217.43 nm，Zeta 电位为-31.48 mV。

图5 金丝桃苷纳米结构脂质载体冻干粉外观

2.7 体外释药研究 取金丝桃苷及其纳米结构脂质载体冻干粉适量（金丝桃苷含量均为40 mg），空白介质制成混悬液，转移至活化透析袋中，手术线将两端封口。以脱气后的蒸馏水为释药介质，于设定取样点各取样5 mL 后立即补加同体积空白介质，8 000 r/min 离心15 min，取上清液，测定累积释放度，结果见图6。由此可知，原料药在前6 h释药较快，累积释放度为21.96%，之后程度趋缓，48 h 内累积释放度仅为33.71%； 纳米结构脂质载体在前8 h 释放较快，累积释放度为44.90%，之后缓慢升高，48 h 内累积释放度为71.77%。

图6 金丝桃苷体外释药曲线（±s，n＝6）

2.8 体内药动学研究

2.8.1 血浆样品处理 参考文献［14］ 报道，取200 μL解冻后血浆样品，加入20 μL 内标 （乙酰苯胺） 溶液（1 000 ng/mL）、500 μL 乙腈［15］，涡旋60 s，4 ℃、8 500 r/min 离心10 min，取上层溶液，45 ℃氮气缓慢吹干得残渣，200 μL 乙腈复溶，4 ℃、8 500 r/min 离心5 min。

2.8.2 线性关系考察 取适量对照品溶液，45 ℃氮气缓慢吹干，空白血浆依次稀释至3 000、1 500、1 000、500、100、50 ng/mL，即得血浆对照品溶液，按“2.8.1” 项下方法处理，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对质量浓度（X） 进行回归，得方程为Y＝0.137 2X-10.11 （r＝0.992 6），在50～3 000 ng/mL 范围内线性关系良好。

2.8.3 方法学考察 取50、1 000、3 000 ng/mL 血浆对照品溶液适量，同一天内在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得金丝桃苷含量RSD 分别为9.61%、5.27%、6.14%，表明该方法日内精密度良好； 于0、1、2、3、4、6 d 同法各测定6 次，测得金丝桃苷含量RSD 分别为9.66、4.10%、6.43%，表明该方法日间精密度良好。取灌胃给药1 h 后血浆样品适量，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得金丝桃苷含量RSD 为9.06%，表明样品在12 h 内稳定性良好。取50、1 000、3 000 ng/mL血浆对照品溶液适量，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得金丝桃苷平均加样回收率分别为89.21%、93.69%、91.74%，RSD 分别为5.37%、8.04%、7.69%。

2.8.4 分组、造模与给药 取金丝桃苷及其纳米结构脂质载体冻干粉适量，加入0.5%CMC-Na 溶液（金丝桃苷质量浓度均为5 mg/mL，现用现配） 制成灌胃液。12 只大鼠随机分为2 组，每组6 只，实验前禁食12 h，自由饮水，以40 mg/kg 剂量给药，于0.5、1、2、3、4、4.5、5、6、8、10、12 h 眼眶后静脉丛取血，置于肝素化离心管中，振荡混匀，3 000 r/min 离心3 min，取上层血浆，密封后冷冻保存。

2.8.5 结果分析 血药浓度-时间曲线见图7，主要药动学参数见表4。由此可知，与原料药比较，纳米结构脂质载体tmax、t1/2延长 （P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相对生物利用度增加至3.19 倍。

图7 金丝桃苷血药浓度-时间曲线（±s，n＝6）

表4 金丝桃苷主要药动学参数（±s，n＝6）

表4 金丝桃苷主要药动学参数（±s，n＝6）

注： 与金丝桃苷比较，**P＜0.01。

参数单位金丝桃苷金丝桃苷纳米结构脂质载体tmaxh1.89±0.333.08±0.52**t1/2h4.90±0.616.74±0.93**Cmaxμg·L-1 1 191.07±155.832 446.35±306.43**AUC0～t μg·L-1·h 4 354.19±628.67 13 897.32±1 688.71**AUC0～∞ μg·L-1·h 5 038.22±689.71 14 906.46±1 846.64**

3 讨论

对于纳米结构脂质载体而言，包封率、载药量、粒径是最主要的指标，包封率较高时载药量可能较低，后者较高时前者亦然，故仅选择1 ～2 个指标来优化处方并不全面［11］。另外，制剂粒径也会影响口服吸收生物利用度［16］，由于本实验希望得到200 nm 粒径以下纳米制剂，故需同时考虑包封率、载药量、粒径这3 个指标。另外，正交试验优化处方时精确度较差，重复性可能存在问题［17］； Box-Behnken 响应面法精确度较高，可全面研究几种因素的交互作用，重复性较高，故本实验采用该方法进行处方优化。

前期报道，金丝桃苷临床用量为90 mg［18］，故成人用药剂量为1.5 mg/kg （平均体质量以60 kg 计），折换成大鼠等效剂量为9.45 mg/kg （大鼠与人等效剂量比为6.3［19］），但受到检测条件的限制，目前药动学实验中所用剂量高于人体实际剂量［19］。另外，大鼠给药剂量为175 mg/kg时无明显毒副作用［20］，结合实际条件，本实验选择40 mg/kg剂量来考察金丝桃苷纳米结构脂质载体体内药动学。

结果显示，金丝桃苷纳米结构脂质载体tmax延长，Cmax、口服生物利用度升高，可能是由于胃肠道对纳米粒黏附性的影响，以及药物从纳米结构脂质载体释放出来需要克服的屏障较多，并且纳米结构脂质载体使原料药比表面积激增，从而促进其溶出；t1/2延长，表明体内循环时间增加；原料药与胃肠道接触面积增加，有助于其经胞间、淋巴转运等进入血液循环［21-22］； 相对生物利用度增加至3.19 倍，高于Shen 等［8］报道（增加210.63%）。但药物口服吸收是一个非常复杂的过程，制剂在胃肠道中的稳定性（粒径增大、药物泄露等）、胃肠道黏膜上黏蛋白的排斥作用等因素均会影响生物利用度提高程度，尚需进一步研究。