基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 信号通路探讨化浊解毒消痈方对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜的保护作用

娄莹莹，李佃贵，杨 倩，李 燕，王思月，王志成，胡 贺

（1.河北省中医院，河北 石家庄 050011； 2.河北省中西医结合胃肠病研究重点实验室，河北 石家庄 050011； 3.河北中医药大学，河北 石家庄 050200）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC） 又称为慢性非特异性溃疡性结肠炎，现病因不明并且反复发作、轻重不等，腹部疼痛、便中带黏液脓血、频繁腹泻、里急后重为其临床表现，病位在乙状结肠和直肠。该病发病率逐年上升，统计发现约有1/5 慢性UC 患者可能发展成结直肠癌［1-2］，称之为“绿色癌症”。UC 难以治愈，容易反复发作，严重影响个人健康和生活质量，对我国公共卫生系统和社会造成巨大的挑战［3］。

UC 普遍被认为与感染、精神心理、先天遗传、自身免疫等综合因素相关，但发病机制尚未完全明确［4］。内质网是细胞内的重要细胞器，肠上皮细胞（intestinal epithelial cells，IECs） 中含有大量丰富的内质网结构，在内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS） 持续、严重的情况下，激活蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK） -真核细胞起始因子2α （eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α） -C/EBP 同源蛋白 （C/EBP homologous protein，CHOP） 凋亡信号通路会引起细胞过度凋亡，导致肠黏膜损伤，是UC 发病的重要病理机制［5-6］。李佃贵教授以化浊解毒法为基本治疗大法，在此基础上提出溃疡性结肠炎浊毒致病论，建立化浊解毒有效方剂——化浊解毒消痈方。前期研究表明，该方通过恢复Th1/Th2平衡、抑制UC 大鼠结肠上皮细胞的过度凋亡发挥抗炎作用［7-8］。本实验进一步从调控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 信号通路角度出发，探讨化浊解毒消痈方对UC 小鼠结肠黏膜的保护作用，从而探讨其深层作用机制，为其临床应用提供客观依据。

1 材料

1.1 药物 化浊解毒消痈方由白头翁12 g、藿香12 g、佩兰12 g、茵陈15 g、黄连12 g、黄柏9 g、当归12 g、白芍20 g、白花蛇舌草15 g、半枝莲12 g、半边莲12 g、秦皮15 g、苦参9 g、广木香9 g 组成，购于河北省中医院中药房，经河北省中医院相聪坤主任药师鉴定为正品。美沙拉嗪肠溶片（0.25 g/片，批号210817），购自葵花药业集团股份有限公司。

1.2 动物 SPF 级健康雄性C57BL/6 小鼠，体质量18 ～22 g，6～8 周龄，购自斯贝福（北京） 生物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京） 2019-0010］，饲养于河北医科大学第四医院实验动物中心动物房［实验动物使用许可证号SYXK （冀） 2022-011］，SPF 级标准环境，温度（23±5）℃，相对湿度30% ～60%，光照/黑暗12 h/12 h。本实验通过河北中医药大学伦理委员会批准（伦理号DWLL2021053）。

1.3 试剂 葡聚糖硫酸钠（DSS，北京百诺威生物科技有限公司，批号S414）； β-actin、eIF2α、ATF4 一抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号 AC2020730004、157018041802、82019051502）； PERK 一抗（美国CST 公司，批号437028）； CHOP 一抗（武汉三鹰生物技术有限公司，批号10003427）。

1.4 仪器 D3024R 台式高速冷冻离心机［大龙兴创实验仪器（北京） 股份公司］； Epoch 酶标检测仪（美国BioTek公司）； NanoDrop2000 超微量分光光度计 （美国Thermo Fisher Scientific 公司）； alphaEaseFC 灰度分析软件（美国Alpha Innotech 公司）； BV-2 垂直电泳仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 将小鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组和化浊解毒消痈方高、中、低剂量组，每组8 只。除正常组外，其余各组给予小鼠2.5%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS） 溶液自由饮用7 d，其间禁水，并每日更换新鲜DSS 溶液，诱导小鼠UC 模型。模型制备成功的标准为（1） 小鼠体质量明显下降，出现腹泻、便血症状； （2） 光镜下HE 染色可见大量炎性细胞浸润，伴有隐窝脓肿，杯状细胞缺失，甚则可见溃疡形成。根据人与小鼠剂量换算［9］，造模成功后化浊解毒消痈方高、中、低剂量组分别灌胃给予28.68、14.34、7.17 g/kg化浊解毒消痈方，美沙拉嗪组灌胃给予0.45 g/kg 美沙拉嗪，正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水，每天1 次，连续7 d。

2.2 疾病活动指数（DAI） 评分 参照Murano 等制定的DAI 评分标准，观察整个实验过程中小鼠的生理状况，包括精神状态、粪便、活动、毛发、体质量、饮食等变化，进行DAI 评分，评分标准见表1。DAI ＝ （体质量下降分数＋粪便性状分数＋便血情况分数） /3。

表1 DAI 评分标准

2.3 结肠黏膜大体观与组织病理学观察 取结肠组织，肉眼观察其形态变化。取部分上述组织，经脱水、包埋、制备切片后行常规HE 染色，于光镜下观察病理形态变化。

2.4 RT-qPCR 法检测结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表达 取100 mg 结肠组织，TRIzol 一步法提取总RNA，使用Nanodrop 2000 超微量分光光度计检测RNA 浓度、纯度，稀释至终质量浓度100 ～500 ng/μL。RNA 于PCR 仪上进行反转录，然后进行PCR 扩增反应，以GAPDH为内参，2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA 相对表达。引物序列见表2。

2.5 Western blot 法检测结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表达 取100 mg 结肠组织，加10 倍量裂解液进行匀浆，于冰上裂解30 min，离心后取上清液，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，蛋白加热变性后上样，经SDS-PAGE电泳、转膜后，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭30 min，加一抗（1 ∶1 000） 4 ℃摇床孵育过夜，次日洗膜3 次，加二抗（1 ∶3 000） 室温孵育30 min，洗膜3 次后在暗室中显影、定影，使用Alpha 软件处理并分析目标条带的光密度值，计算目的蛋白相对表达。

2.6 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者组间比较采用LSD 检验，方差不齐者组间比较采用Dunnett’s 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠一般情况 正常组小鼠皮毛光滑，精神状态佳，反应灵敏，饮水量及进食量正常，体质量稍增加； 模型组小鼠皮毛光泽度差，易掉毛，精神状态差，反应迟钝，饮水量、进食量及体质量下降； 给药7 d 后，美沙拉嗪组和化浊解毒消痈方各剂量组小鼠一般情况改善，掉毛减少，精神状态尚可，活动度尚可，饮水量、进食量及体质量有一定程度恢复。实验过程中模型组死亡2 只，化浊解毒消痈方高、中剂量组各死亡1 只，低剂量组死亡1 只。

3.2 化浊解毒消痈方对UC 小鼠DAI 评分的影响 与正常组比较，模型组小鼠DAI 评分升高（P＜0.05）； 与模型组比较，化浊解毒消痈方各剂量组和美沙拉嗪组小鼠DAI 评分均降低（P＜0.05）； 与美沙拉嗪组比较，化浊解毒消痈方高剂量组小鼠DAI 评分无明显变化（P＞0.05），中、低剂量组小鼠DAI 评分升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组小鼠DAI 评分比较（±s）

表3 各组小鼠DAI 评分比较（±s）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与美沙拉嗪组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只DAI 评分/分正常组80.00±0.00模型组62.25±0.24*美沙拉嗪组80.92±0.24＃化浊解毒消痈方高剂量组71.07±0.43＃化浊解毒消痈方中剂量组71.67±0.27＃▲化浊解毒消痈方低剂量组61.62±0.30＃▲

3.3 化浊解毒消痈方对UC 小鼠结肠组织病理形态的影响 正常组小鼠结肠组织正常，黏膜光滑，可见上皮组织与腺体结构完整、排列整齐，未出现充血、水肿及溃疡；模型组小鼠结肠组织严重损伤，黏膜水肿、充血，发现糜烂、溃疡灶形成，腺体排列紊乱，有大量炎性细胞浸润肠组织； 与模型组比较，化浊解毒消痈方高剂量组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织病理性损伤缓解，黏膜基本光滑，充血、水肿程度减轻，溃疡较少并出现已愈合的溃疡面，有基本完整的腺体结构伴随较少的被炎性细胞浸润的肠组织； 化浊解毒消痈方中、低剂量组结肠组织病理性损伤减轻，黏膜表面欠光滑，轻度充血水肿，可见溃疡面和少量被破坏的腺体结构，出现溃疡面及边缘覆少量新生腺体，见图1。

图1 各组小鼠结肠组织HE 染色

3.4 化浊解毒消痈方对UC 小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表达升高（P＜0.05）； 与模型组比较，化浊解毒消痈方各剂量组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表达降低（P＜0.05）； 与美沙拉嗪组比较，化浊解毒消痈方高剂量组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表达无明显变化（P＞0.05），中、低剂量组PERK、eIF2α、ATF4、CHOPmRNA 表达升高（P＜0.05），见表4。

表4 各组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA 表达比较（±s）

表4 各组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA 表达比较（±s）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与美沙拉嗪组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只PERKeIF2αATF4CHOP正常组80.68±0.070.77±0.090.89±0.090.78±0.11模型组61.71±0.14*1.90±0.18*2.08±0.14*2.34±0.29*美沙拉嗪组80.92±0.05＃1.07±0.04＃1.16±0.05＃1.09±0.14＃化浊解毒消痈方高剂量组70.88±0.09＃1.06±0.13＃1.19±0.12＃1.11±0.12＃化浊解毒消痈方中剂量组71.09±0.11＃▲1.34±0.13＃▲1.44±0.11＃▲1.43±0.09＃▲化浊解毒消痈方低剂量组61.39±0.12＃▲1.62±0.13＃▲1.70±0.12＃▲1.85±0.10＃▲

3.5 化浊解毒消痈方对UC 小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表达升高（P＜0.05）； 与模型组比较，化浊解毒消痈方各剂量组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表达降低（P＜0.05）； 与美沙拉嗪组比较，化浊解毒消痈方高剂量组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表达无明显变化 （P＞0.05），中、低剂量组PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表达升高（P＜0.05），见表5、图2。

图2 各组小鼠结肠组织 PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白条带

表5 各组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表达比较（±s）

表5 各组小鼠结肠组织PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表达比较（±s）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与美沙拉嗪组比较，▲P＜0.05。

组别动物数/只PERK/β-actineIF2α/β-actinATF4/β-actinCHOP/β-actin正常组80.30±0.030.22±0.020.08±0.010.19±0.01模型组60.88±0.02*0.49±0.14*0.46±0.03*0.66±0.02*美沙拉嗪组80.38±0.01＃0.25±0.01＃0.12±0.01＃0.30±0.16＃化浊解毒消痈方高剂量组70.41±0.01＃0.27±0.01＃0.18±0.02＃0.29±0.12＃化浊解毒消痈方中剂量组70.57±0.02＃▲0.31±0.02＃▲0.17±0.02＃▲0.45±0.16＃▲化浊解毒消痈方低剂量组60.71±0.04＃▲0.38±0.02＃▲0.27±0.12＃▲0.60±0.17＃▲

4 讨论

UC 作为炎症性肠病中的一种，发病率和患病率增长迅速，预计到2025 年我国将有150 万例炎症性肠病患者［10］，且具有发展成结直肠癌的风险［11-13］。UC 发生发展的重要原因之一是肠上皮细胞的过度凋亡［14］。通过抑制肠上皮细胞的过度凋亡，可以促进肠黏膜愈合，实现治疗UC 的作用。

细胞凋亡可以通过内在线粒体通路、外在死亡受体通路和内质网通路来触发。内质网通路主要是通过ERS 诱导细胞凋亡，强烈持续的ERS 是诱导肠上皮细胞凋亡的重要途径。细胞器受到内外环境应激因素的刺激，胞内稳态发生变化，尤其是内质网（endoplasmic reticulum，ER） 功能紊乱，导致未折叠或错误折叠的蛋白大量堆积，引起ERS，细胞内稳态被破坏，引起蛋白质翻译程度下降、靶基因转录上调，这种反应称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）［15］。严重且持续的ERS 会造成内质网反应超负荷，促生存模式的UPR 会立即转为促凋亡模式，下游通路PERK/eIF2α/ATF4、IRE1/JNK/caspase12 和ATF6 分别激活，形成ERS 介导的细胞凋亡信号转导途径［16］。本实验发现通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 途径可以调控ERS介导细胞凋亡。PERK 通过对自身磷酸化并且催化elF2α，对细胞中蛋白质的合成起到抑制作用，进而减轻内质网压力，同时通过活化转录活化因子4 （activating transcription factor 4，ATF4），上调内质网应激诱导细胞凋亡标志性蛋白CHOP 的表达。CHOP 一方面对抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达抑制，另一方面对抗促凋亡蛋白基因BAX/BA、BIM 的表达上调，破坏内质网膜完整性，使Ca2＋向胞质外流； 同时CHOP 激活一系列信号传导途径上调caspase3 表达，最终诱发细胞凋亡［17-19］。研究发现，肠上皮细胞发生ERS 时，PERK/eIF2α 通路的激活可导致UC 发生发展［20-21］。

目前中医药治疗UC 在临床上效果显著。国医大师李佃贵教授首创中医新理论—— “浊毒理论”，认为浊毒稽留体内，会对人体气血、脏腑等造成影响，致使人体阴阳平衡失调而发病，“浊毒” 贯穿UC 发展始终，肝郁、脾弱、肾虚为本，以浊毒、瘀为标［22］。化浊解毒消痈方由白头翁汤、当归芍药散、香连丸三方加减化裁而来，治疗UC 疗效显著。本研究结果表明，经化浊解毒消痈方干预后，UC 小鼠DAI 评分降低，结肠组织病理形态有所改善。与正常组比较，模型组小鼠PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 表达均升高； 经化浊解毒消痈方给药后，小鼠PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 表达均降低，其中高剂量组作用最佳，并且与美沙拉嗪组效果相当。

综上所述，DSS 诱导UC 小鼠中，ERS 参与了UC 发生发展，化浊解毒消痈方对UC 小鼠的肠黏膜保护作用可能是通过抑制ERS 介导的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP 信号通路，抑制肠上皮细胞凋亡，减轻肠道黏膜损伤实现的。本研究为开发UC 相关的新靶点药物提供了新的依据。课题组将进一步挖掘化浊解毒中药深层作用机制，探讨与中医“浊毒”契合的分子基础，为临床治疗UC 进一步提供特色、有效药物。