基于肠道菌-神经递质-脑轴探讨柴胡加龙骨牡蛎汤对大鼠抑郁症的改善作用

王亚楠，孙 宏，王秀珍，梁国英，蔡国锋，刘 凯，裴思颖，张金朋*

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001； 3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

抑郁症是现代社会一种普遍的、危及生命的、高度复发的精神疾病，主要表现为快感缺乏、情绪抑郁，导致抑郁症患者的复发率、死亡率和自杀率较高［1-2］，可能成为世界范围内残疾的主要来源［3］。目前抑郁症的机制研究主要集中在神经递质减少、下丘脑-垂体-肾上腺轴改变和免疫系统异常等方面［4-5］。新的证据表明肠道菌群不仅影响胃肠功能，还可通过微生物-肠道-脑轴调节中枢神经系统的生理功能和行为［6-9］。研究者通过16S rRNA 基因测序方法发现重度抑郁症（MDD） 患者显示出肠道微生物群组成的剧烈改变［10-11］，即与健康对照组比较，抑郁受试者的拟杆菌门、变形杆菌门和放线菌门水平增加，厚壁菌门数量减少。以上结果表明肠道菌群与抑郁症之间存在一定联系。探究肠道菌群在抑郁状态下对大脑功能的影响对于开发治疗抑郁症的药物具有重要意义。

柴胡加龙骨牡蛎汤记载于张仲景《伤寒论》，其有和解少阳、镇惊安神之功，目前临床常用其治疗抑郁症［12］。因此，本研究应用慢性不可预见性温和应激（CUMS） 法制备抑郁大鼠模型，采用肠道微生物测序和脑组织神经递质定量结合的方式，探讨柴胡加龙骨牡蛎汤通过作用于肠道菌群调控神经递质对抑郁症的作用机制。

1 材料

1.1 动物 80 只SPF 级SD 雄性大鼠，8 周龄，体质量（200±20） g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供［实验动物生产许可证号SCXK （黑） 2019-001］，饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心屏障系统内，环境温度（24±2）℃，相对湿度50% ～70%，12 h/12 h 昼夜交替照明，定时定点换水并添加饲料，每天更换垫料。本实验经黑龙江中医药大学伦理委员会审批（伦理号HZYLLBA201903）。

1.2 仪器 DK-98-II 型恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）； SP131010-33Q 型涡旋振荡器 （美国Barnstead公司）； ABI GeneAmp®9700 型 PCR 仪 （ 美国 Applied Biosystems 公司）； EP5417R 型高速台式离心机 （德国Eppendorf 公司）； RT-6100 型酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）； SA215 型旷场装置（江苏赛昂斯生物科技有限公司）。

1.3 试剂与药物 柴胡加龙骨牡蛎汤中药颗粒剂［组方药材柴胡12 g、黄芩9 g、龙骨15 g、牡蛎15 g、党参9 g、桂枝9 g、茯苓15 g、半夏9 g、大黄9 g、珍珠母（代铅丹）15 g、生姜9 g、大枣10 g，北京康仁堂药业有限公司］。盐酸氟西汀胶囊（法国礼来公司，批号9492AA）。大鼠五羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素 （NE）、乙酰胆碱 （Ach）ELISA 试剂盒 （江苏酶免实业有限公司，货号MM-71127R2、MM-0556R2、MM-0517R2 ）； E.Z.N.A.®soil DNA kit （美国BioTek 公司）； AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （美国Axygen 公司）； QuantusTMFluorometer ［普洛麦格（北京） 生物技术有限公司］。

2 方法

2.1 分组、造模与给药 大鼠随机分为正常组、模型组、西药组和中药低、中、高剂量组，于屏障系统适应性饲养1 周后，除正常组外其余各组大鼠采用慢性不可预见性温和应激（CUMS） 法制备抑郁模型［13-14］，刺激方法包括禁水（24 h）、夹尾（距尾根1 cm，持续3 min）、冷水游泳（4 ℃，持续5 min）、束缚（3 h）、热刺激（45 ℃，持续5 min）、禁食（24 h）、昼夜颠倒（白天给予黑暗环境，夜晚给予光照）、潮湿垫料（24 h），每天随机选择2 种不同刺激方法，在相邻2 d 不重复使用，持续49 d。于刺激第29天各组开始灌胃给药，给药剂量按照大鼠与人剂量折算系数计算得出，每天1 次，中药低、中、高剂量组分别给予柴胡加龙骨牡蛎汤颗粒剂2.89、5.78、11.56 g/kg （相当于成人每日服药量的1、2、5 倍），西药组给予盐酸氟西汀2.06 mg/kg，正常组和模型组给予等体积生理盐水。

2.2 行为学评估 分别于实验的第28 天（造模第28 天，未给药第0 天）、49 天（给药第21 天） 2 个时间点进行旷场实验、强迫游泳实验，评估各组大鼠造模情况、给药后药效。

2.2.1 旷场实验 在安静、光线稳定的环境中，将大鼠放入长、宽各100 cm，高为40 cm 的黑色立方体敞箱中，将敞箱底部划分为25 个大小相等正方形格子，以中间9 个格子为中央区，周围16 个格子为周围区，轻轻将大鼠放入最中间的格子，视频记录分析5 min 内在敞箱中的水平运动总距离、垂直运动次数、中央停留区时间。

2.2.2 强迫游泳实验 在安静、光线稳定的环境中，将各组大鼠轻轻置于直径40 cm、高62 cm 的圆形透明水桶中，水深约为30 cm，水温22～25 ℃，保证大鼠头部露出水面时后肢无法触及水桶底部，计时6 min，视频记录在后4 min内的不动时间。实验期间，及时清理大鼠粪便并更换清水，结束后擦干水分。

2.3 取材 行为学实验结束后，每组收集5 份大鼠粪便，每份取3～5 粒，置于冻存管中，暂存于液氮中，用于16S rRNA 基因测序。收集粪便后，以3% 戊巴比妥钠麻醉大鼠，冰上开颅取全脑，仔细分离海马组织后称定质量，随后置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 ELISA 法检测海马组织神经递质水平 按照试剂盒说明书制备5-HT、NE、Ach 梯度溶液，检测海马组织三者水平。

2.5 16S rRNA 测序 通过Illumina 公司的Miseq PE300 平台进行测序，使用5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′序列对16S rRNA 基因V3-V4 可变区进行PCR 扩增，每个样本重复3 次。以NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 进行建库，原始测序序列质控和拼接过程使用fastp 软件、FLASH 软件分析。根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类并剔除嵌合体，基于得到的OTU 序列进行后续的微生物组学分析。

2.6 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况 正常组大鼠饮食、饮水正常，活动自如，反应灵敏，排便正常，体型偏胖，健康状况良好； 模型组大鼠饮食、饮水、排便量减少，大便干燥，精神状态较差，体型瘦弱； 与模型组比较，中药各剂量组、西药组大鼠饮食、饮水、精神状态、体质量好转，排便量、大便状态恢复。

3.2 柴胡加龙骨牡蛎汤对大鼠行为学的影响

3.2.1 旷场实验 造模第28 天，如表1 所示，与正常组比较，模型组大鼠水平运动总距离、中央区进入次数、中央区停留时间减少（P＜0.05）； 模型组、各给药组水平运动总距离、中央区进入次数、中央区停留时间无显著差异（P＞0.05），表明造模成功。

表1 造模第28 天各组大鼠旷场实验结果（±s，n＝8）

表1 造模第28 天各组大鼠旷场实验结果（±s，n＝8）

注： 与正常组比较，*P＜0.05。

组别水平运动总距离/m中央区进入次数/次中央区停留时间/s正常组24.40±1.7119.4±1.1450.62±1.56模型组8.94±1.77*4.8±0.84*9.30±0.73*中药低剂量组8.94±0.174.8±1.309.31±0.44中药中剂量组8.71±0.464.6±1.349.24±0.42中药高剂量组9.07±1.264.2±0.839.50±1.38西药组9.31±1.274.4±0.899.46±1.55

给药第21 天，如表2 所示，与正常组比较，模型组大鼠水平运动总距离、中央区进入次数、中央区停留时间减少（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组大鼠水平运动总距离、中央区进入次数、中央区停留时间增加（P＜0.05）；与西药组比较，中药高剂量组大鼠水平运动总距离、中央区进入次数、中央区停留时间无明显变化（P＞0.05），而中药低、中剂量组大鼠水平运动总距离、中央区进入次数、中央区停留时间减少（P＜0.05）。

表2 给药第21 天各组大鼠旷场实验结果（±s，n＝8）

表2 给药第21 天各组大鼠旷场实验结果（±s，n＝8）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与西药组比较，＆P＜0.05。

组别水平运动总距离/m中央区进入次数/次中央区停留时间/s正常组29.59±1.0819.6±1.1450.99±1.75模型组13.03±1.79*4.6±0.89*5.68±1.05*中药低剂量组15.85±0.76＃＆8.8±0.84＃＆ 18.48±1.32＃＆中药中剂量组18.67±0.63＃＆11.6±0.89＃＆ 28.69±1.08＃＆中药高剂量组23.38±1.99＃15.2±1.64＃39.46±1.46＃西药组27.29±1.94＃16.6±1.82＃40.19±1.39＃

3.2.2 强迫游泳实验 如表3 所示，造模第28 天，与正常组比较，模型组大鼠强迫游泳不动时间增加（P＜0.05）。给药第21 天，与正常组比较，模型组大鼠强迫游泳不动时间增加（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组大鼠强迫游泳不动时间减少（P＜0.05）； 中药各剂量组大鼠强迫游泳不动时间多于西药组（P＜0.05）。

表3 各组大鼠强迫游泳不动时间比较（s，±s，n＝8）

表3 各组大鼠强迫游泳不动时间比较（s，±s，n＝8）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与西药组比较，＆P＜0.05。

组别造模第28 天给药第21 天正常组42.29±1.6140.42±2.01模型组79.09±1.92*108.51±2.92*中药低剂量组78.97±2.5885.99±2.32＃＆中药中剂量组79.30±3.1576.43±2.47＃＆中药高剂量组78.61±2.2953.84±2.25＃＆西药组78.84±3.1348.59±1.31＃

3.3 柴胡加龙骨牡蛎汤对大鼠海马组织神经递质水平的影响 如表4 所示，与正常组比较，模型组大鼠海马组织5-HT、NE、Ach 水平降低（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组大鼠海马组织5-HT、NE、Ach 水平升高（P＜0.05）；与西药组比较，中药高剂量组大鼠海马组织NE、Ach 水平无明显变化（P＞0.05），各剂量组大鼠海马5-HT 水平降低（P＜0.05）。

表4 各组大鼠海马组织神经递质水平比较（μg/mg，±s，n＝8）

表4 各组大鼠海马组织神经递质水平比较（μg/mg，±s，n＝8）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与西药组比较，＆P＜0.05。

组别5-HTNEAch正常组0.45±0.0060.17±0.0110.42±0.006模型组0.22±0.007*0.08±0.004*0.26±0.009*中药低剂量组0.29±0.006＃＆0.10±0.004＃＆0.29±0.006＃＆中药中剂量组0.34±0.008＃＆0.12±0.004＃＆0.32±0.005＃＆中药高剂量组0.39±0.004＃＆0.14±0.007＃0.35±0.007＃西药组0.44±0.009＃0.15±0.003＃0.37±0.009＃

3.4 柴胡加龙骨牡蛎汤对大鼠肠道菌群的影响

3.4.1 肠道菌群物种多样性分析 如图1A ～1B 所示，Shannon、Simpson 的稀释性曲线均已趋向平缓，表明所有样本群落丰富度、多样性、覆盖度、均匀度良好，测序数据量足够大，可充分反映各组大鼠粪便样本中绝大部分的肠道微生物多样性信息，能用于后续微生物组学分析。如图1C～1D 所示，与正常组比较，模型组Shannon 指数降低（P＜0.05），Simpson 指数升高（P＜0.05），表明CUMS 诱导抑郁症造模使大鼠肠道菌群的物种丰富度、多样性升高；与模型组比较，各给药组Shannon 指数升高（P＜0.05），Simpson 指数降低（P＜0.05），表明中药和西药均可降低CUMS 诱导抑郁症模型大鼠的肠道菌群多样性。

图1 各组大鼠肠道菌群α 多样性分析（±s，n＝5）

3.4.2 肠道菌群结构分析 采用基于OTU 的主成分分析（PCA，图2A）、weighted UniFrac 主坐标分析（PCoA，图2B）、非度量多维尺度分析（NMDS，图2C） 评估各组微生物群落之间的差异。由此可知，各组样本内部均能够聚类，表明肠道菌群趋于一致； 正常组和模型组菌群结构组成存在差异（P＜0.05），表明CUMS 诱导抑郁症模型大鼠肠道菌群结构发生紊乱； 中药组和西药组肠道菌群结构偏离模型组，并趋向正常组，表明中药和西药可使抑郁症大鼠的肠道菌群结构向正常状态回调。

图2 各组大鼠肠道菌群β 多样性分析（n＝5）

3.4.3 不同分类水平物种组成分析 如图3A 所示，在门水平上，与正常组比较，模型组大鼠粪便样本中拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门 （Proteobacteria） 相对丰度升高，厚壁菌门（Firmicutes） 相对丰度降低； 与模型组比较，中药组可升高厚壁菌门丰度，降低拟杆菌门和变形菌门丰度。如图3B 所示，在纲水平上，与正常组比较，模型组大鼠粪便样本中梭菌纲（Clostridia）、杆菌纲（Bacilli）丰度降低，拟杆菌纲 （Bacteroidia）、丙型变形菌纲（Gammaproteobacteria） 丰度升高； 与模型组比较，中药组可升高梭菌纲和杆菌纲相对丰度，降低拟杆菌纲、丙型变形菌纲相对丰度。结果表明，各组间肠道菌群组成有着高度的特异性，CUMS 诱导抑郁症大鼠的肠道菌群中有益菌丰度减少，有害菌丰度增加，而柴胡加龙骨牡蛎汤给药可增加抑郁症大鼠肠道菌群中益生菌丰度。

图3 各组大鼠肠道菌群在门水平（A）、纲水平（B） 上的组成

3.4.4 关键差异菌属分析 多个分组间比较采用线性判别效应量分析（LEfSe），结果见图4A。各组中富集的差异菌属用不同颜色表示，根据线性判别分析值（LDA score） 大于2、组间非参数因子秩和验检筛选差异菌属，见图4B。如表5 所示，与正常组比较，模型组大肠杆菌-埃希氏菌、拟杆菌丰度升高（P＜0.05）； 与模型组比较，各给药组大肠杆菌-埃希氏菌、拟杆菌丰度降低（P＜0.05），表明中药和西药均具有减少CUMS 诱导抑郁症大鼠肠道内有害菌的作用。值得注意的是，与正常组比较，模型组乳酸杆菌（g_Lactobacillus） 丰度降低（P＜0.05）； 与模型组比较，中药各剂量组乳酸杆菌丰度升高（P＜0.05），表明中药可特异性地升高肠道中有益菌丰度。

表5 各组大鼠肠道中细菌相对丰度比较（±s，n＝5）

表5 各组大鼠肠道中细菌相对丰度比较（±s，n＝5）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05。

菌属正常组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组西药组g_Escherichia-Shigella32.0±52.9915 326.8±967.10*7 388.8±508.50＃1 219.0±1 474.41＃62.8±111.88＃2 984.0±3 898.59 g_Bacteroides48.4±61.543 430.8±3 952.47* 1 129.4±164.56＃838.0±1 781.34＃169.2±154.02＃1 064.8±1 127.40 g_Coriobacteriaceae_UCG-0027.8±7.291 434.8±1 661.91*291.6±229.03＃102.2±115.01＃76.2±38.86＃189.6±334.90 g_UBA18192.2±1.79163.0±179.14*122.8±215.14＃15.6±13.74＃13.2±22.01＃54.6±29.48 g_Fusicatenibacter327.2±538.785.2±10.03*0.6±1.34＃23.2±31.01＃1 516.8±1 329.75＃12.6±13.56 g_Lachnospiraceae_ND3007_group12.2±15.300.00±0.00*0.8±1.79＃15.8±34.77＃35.6±70.18＃0.2±0.45 g_Lactobacillus11 684.6±9 145.49569.0±883.43*3 472.8±4 724.47＃ 6 426.4±6 197.74＃ 8 390.8±5 156.44＃1 373.6±1 443.13 g_Marvinbryantia25.2±35.911.0±1.22*30.2±31.54＃24.2±34.36＃45.4±43.51＃4.8±8.56 g_UCG-008151.6±273.990.0±0.00*2.0±3.94＃73.0±142.94＃199.4±261.87＃153.8±164.91＃g_Enterococcus9.2±10.85439.8±162.85*389.0±442.24＃2 141.0±4 760.59＃4.4±6.54＃19.6±15.18＃

3.4.5 肠道菌群调节脑功能的作用分析 如图5 所示，肠道菌属g_Escherichia-Shigella、g_Bacteroides、g_Coriobacteriaceae_UCG-002、g_UBA1819、g_Anaerostipes、g_Enterococcus与大鼠强迫游泳实验不动时间呈正相关（P＜0.05），与旷场实验水平运动总距离、中央区进入次数、中央区停留时间及5-HT、NE、Ach 水平呈负相关（P＜0.05）；g_Fusicatenibacter，g_Lachnospiraceae_ND3007_group，g_Lactobacillus，g_Marvinbryantia，g_UCG-008 与大鼠强迫游泳实验不动时间呈负相关（P＜0.05），与旷场实验水平运动总距离、中央区进入次数、中央区停留时间及5-HT、NE、Ach 水平呈正相关（P＜0.05）。结果表明，多种肠道菌属与柴胡加龙骨牡蛎汤药效有关联，抑郁症大鼠多种抑郁样症状受到肠道中有害菌和益生菌的共同调节。

图5 肠道细菌与行为学和生理生化指标的相关性分析（n＝25）

4 讨论

本研究采用16S rRNA 基因测序方法，探索柴胡加龙骨牡蛎汤对CUMS 诱导的抑郁症大鼠肠道微生物群和粪便代谢表型的影响。结果表明，各组大鼠肠道微生物群落中各个层级的丰度存在差异； 同时，在CUMS 造模后，宿主神经递质也受到干扰，表明抑郁症不仅改变了肠道菌群，还影响了宿主神经递质代谢，最终导致宿主抑郁样行为。柴胡加龙骨牡蛎汤干预可调节肠道菌群，增加抑郁症大鼠肠道菌群中益生菌丰度，表明肠道菌群的改变可能调节宿主代谢影响脑内神经递质，进而改善抑郁。

研究者最近利用16S rRNA 基因测序发现，抑郁症会影响重度抑郁症患者微生物群的稳定性［15］，与健康对照组比较，抑郁症患者拟杆菌门、变形菌门和放线菌门丰度增加，而厚壁菌门丰度减少。本研究发现，模型组大鼠拟杆菌门丰度升高和厚壁菌门丰度降低； 而柴胡加龙骨牡蛎汤给药可增加抑郁症大鼠肠道中有益菌群厚壁菌门、梭菌纲、杆菌纲、乳酸杆菌和瘤胃球菌丰度，降低有害菌拟杆菌门丰度。

饮食可作为调节抑郁症的重要干预方式［16］。饮食进入人体消化系统，代谢产生的神经递质可通过肠脑轴作用于宿主大脑［17］，肠道微生物群和脑组织神经递质代谢的变化可能是消化系统受损的直接后果，研究发现与肠道菌群有关的血清素代谢、色氨酸代谢、γ-氨基丁酸代谢对宿主的脑功能有重要作用［18-20］。本研究发现，柴胡加龙骨牡蛎汤可通过调节肠道菌群影响抑郁症大鼠海马组织5-HT、NE、Ach 水平，表明肠道菌-神经递质-脑轴是柴胡加龙骨牡蛎汤治疗抑郁症的重要机制。多种肠道益生菌和有害菌与大鼠的行为学指标密切相关。此外，本研究发现CUMS 造模的大鼠排便不通畅，但未进行量化分析。本研究结果表明，肠道微生物群是柴胡加龙骨牡蛎汤发挥治疗抑郁效果的重要作用靶点，调节肠道菌群的组成和功能有助于抑郁患者的临床治疗。

综上所述，柴胡加龙骨牡蛎汤对CUMS 诱导的大鼠抑郁症具有改善作用，可调节其相关的肠道菌群紊乱，改变宿主脑组织代谢稳态。探究肠脑轴与疾病的关系有助于开发基于菌群的疾病诊断、预防和治疗工具。