紫草素对白癜风小鼠黑素细胞功能的影响

王 解，彭子辉，王润和，李进先，李 刚

［襄阳市中心医院（湖北文理学院附属医院） 皮肤科，湖北 襄阳 441003］

白癜风是一种多见于青少年的皮肤科常见疾病，患者黑素细胞出现数目减少及功能受损，临床症状以毛发、黏膜或皮肤色素脱失为主，发病部位常定位于手脚，但有时也能蔓延到面部，使患者常因外表而痛苦尴尬，导致部分患者抑郁［1-2］。白癜风是一种慢性炎症性皮肤病，免疫T 细胞的分化参与介导其发病过程，Th17 细胞及其表达合成的促炎因子IL-17 在白癜风患者体内增加，抑制Th17 细胞分化，可保护黑素细胞，减轻白癜风患者色素脱失症状［3-4］；IL-23 作为一种炎性因子，可激活Th17 细胞信号，引发炎症，在胸腺炎等多种自身免疫性疾病中发挥重要调控作用［5］，且IL-23 及Th17 细胞因子IL-17 水平在白癜风患者血清中升高［6］，表明IL-23/Th17 信号是白癜风的一个潜在治疗靶点。紫草素是紫草科紫草LithospermumerythrorhizonSieb.et Zucc.根中的活性成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等生物学功效，可降低炎症因子IL-6、IL-17 和IL-23 水平，抑制其促炎症作用，改善银屑病患者症状，对白癜风也有较好疗效［7-8］，但其药理机制目前还未明确。本文以紫草素处理白癜风模型小鼠，探讨其对白癜风小鼠黑素细胞功能的影响及作用机理。

1 材料

1.1 动物 C57BL/6 小鼠，SPF 级，体质量13 ～17 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （鲁） 2019-0003］，在动物中心适应饲养1 周，温度21 ℃，相对湿度45%。实验过程均遵循国家及单位关于实验动物保护与使用的准则，并经本单位实验动物伦理委员会批准（伦理号2019-10）。

1.2 试剂 氢醌、羧甲基纤维素钠 （批号20170704、F20090916，国药集团化学试剂有限公司）。紫草素对照品（纯度≥98%，美国Sigma-Aldrich 公司）。白癜风胶囊（0.45 g/粒，批号20170527，长春银诺克药业有限公司）。HE 染色试剂盒、小鼠IL-23 ELISA 试剂盒、小鼠IL-17 ELISA 试剂盒、红细胞裂解液、动物总RNA 快速抽提试剂盒［生工生物工程（上海） 股份有限公司］； 小鼠α-黑色素细胞刺激素（α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH）ELISA 试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）； 反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司）；IL-23、β-actin、IL-17 引物（苏州吉玛基因股份有限公司）； FITCCD4 单克隆抗体、FITC-IL-17 单克隆抗体（上海北诺生物科技有限公司）。

1.3 仪器 Multiskan FC 型酶标仪（上海腾名生物科技有限公司）； DM4000 型光学显微镜、RM2245 型切片机（德国徕卡公司）； 7900HT 型荧光定量PCR 仪、3900 型高通量DNA 合成仪（美国应用生物系统公司）； FACSCalibur 型流式细胞仪（美国Becton Dicknson 公司）； TD-4M 型低温高速离心机（济南来宝医疗器械有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立、分组及给药 小鼠随机分为对照组、模型组、白癜风胶囊（504 mg/kg） 组和紫草素低、中、高剂量（20、40、80 mg/kg） 组，每组12 只。除对照组外其余各组按参照文献［9］ 报道制备白癜风模型，小鼠颈背部脱毛，每天均匀涂抹0.5 mL 2.5%氢醌软膏（将1 g 羧甲基纤维素钠、2.5 g 氢醌加到100 mL 去离子水中，磁力搅拌1 h，即得），持续60 d （每5 d 脱毛1 次），观察到小鼠脱毛区毛发、肤色变白，表示造模成功。对照组12 只小鼠于背部脱毛处每日均匀涂抹空白基质（将1 g 羧甲基纤维素钠加到100 mL 去离子水中，磁力搅拌1 h，即得）。

以生理盐水溶解紫草素、白癜风胶囊内容物，制得2、4、8 mg/mL 紫草素［10］，50.4 mg/mL 白癜风胶囊［11］药液，用药组小鼠每天上午10： 00 灌胃给予对应药液10 mL/kg，模型组、对照组小鼠每天上午10： 00 灌胃给予生理盐水10 mL/kg，每天1 次，持续21 d。

2.2 小鼠毛发脱色情况检测及标本采集 末次给药24 h后，观察小鼠涂药（2.5%氢醌软膏） 部位和非涂药部位脱色情况，参照文献［12］ 标准进行评分，每个部位总分5分。毛发基本无脱色为0 分，0＜毛发脱色面积≤10% 为1分，11%≤毛发脱色面积≤25%为2 分，26%≤毛发脱色面积≤50% 为3 分，51% ≤毛发脱色面积≤75% 为4 分，76%≤毛发脱色面积≤100%为5 分。脱颈处死小鼠，取腹主动脉血2.0 mL，6 只小鼠血液中加入红细胞裂解液，冰水浴孵育0.5 h，100×g离心，取细胞沉淀备用； 剩余6 只小鼠血液100×g离心，取血清备用（保存于-80 ℃）。剪取小鼠造模处皮肤组织0.5 g （保存于液氮），再剪取小鼠造模处皮肤组织（1 cm×1 cm），多聚甲醛固定。

2.3 HE 染色观察小鼠皮肤病理组织学 取“2.2” 项下固定的小鼠皮肤组织，脱水、透明、包埋后切片，按照试剂盒说明书方法进行HE 染色，封片后置于显微镜下观察皮肤组织病理形态，并扫描横切面，采用CaseViewer 软件分析同等放大倍数下视野中黑色素毛囊、基底层黑素细胞数。

2.4 小鼠血清α-MSH、TYR、IL-23、IL-17 水平检测 取“2.2” 项下小鼠血清，冰水浴中提前解冻，按照ELISA 试剂盒说明书检测α-MSH、TYR、IL-23、IL-17 水平。

2.5 小鼠外周血Th17 细胞比例检测 取“2.2” 项下小鼠外周血细胞沉淀，以PBS 缓冲液洗涤后重悬，计数后调整密度为1.0×106/mL，取1 mL 悬液，依次加入FITC-CD4、FITC-IL-17 单克隆抗体混匀，上机检测，计算Th17 细胞比例。

2.6 小鼠皮肤组织IL-23、IL-17 mRNA 表达检测 取“2.2” 项下于-80 ℃保存的小鼠皮肤组织，提取总RNA 后进行逆转录反应，制得cDNA，均按照相应试剂盒说明书进行操作，配制RT-qPCR 反应预混液，加入皮肤组织cDNA 模板，混匀后上机进行PCR 扩增，反应体系配制和反应条件设定均按照荧光定量PCR 试剂盒说明书指导进行，以β-actin基因为内参，2-ΔΔCT法分析IL-23、IL-17 mRNA 相对表达，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 统计学分析 通过SPSS 24.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 紫草素对白癜风小鼠毛发脱色评分的影响 与对照组比较，模型组小鼠涂药部位、非涂药部位毛发脱色评分升高（P＜0.05）； 与模型组比较，紫草素各剂量组小鼠涂药部位、非涂药部位毛发脱色评分降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性（P＜0.05）； 与白癜风胶囊组比较，紫草素高剂量组小鼠涂药部位、非涂药部位毛发脱色评分无明显变化（P＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠毛发脱色评分比较（分，±s，n＝12）

表2 各组小鼠毛发脱色评分比较（分，±s，n＝12）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与紫草素低剂量组比较，△P＜0.05； 与紫草素中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别涂药部位毛发脱色评分非涂药部位毛发脱色评分对照组0±00±0模型组4.25±0.67*2.00±0.43*紫草素低剂量组2.75±0.52＃1.42±0.16＃紫草素中剂量组1.42±0.31＃△0.75±0.08＃△紫草素高剂量组0.42±0.05＃△▲0.08±0.03＃△▲白癜风胶囊组0.50±0.10＃△▲0.17±0.04＃△▲

3.2 紫草素对白癜风小鼠皮肤病理组织学和黑素细胞的影响 对照组小鼠皮肤组织表皮无增生，含有大量黑色素毛囊及基底层黑素细胞； 与对照组比较，模型组小鼠皮肤组织表皮增生，黑色素毛囊及基底层黑素细胞数降低（P＜0.05）； 与模型组比较，紫草素各剂量组小鼠皮肤组织表皮增生减轻，黑色素毛囊及基底层黑素细胞数增加（P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与白癜风胶囊组比较，紫草素高剂量组小鼠皮肤组织表皮增生程度相似，黑色素毛囊、基底层黑素细胞数无明显变化（P＞0.05），见图1、表3。

图1 各组小鼠皮肤组织HE 染色（×200）

表3 各组小鼠黑色素毛囊、基底层黑素细胞数比较（个，±s，n＝12）

表3 各组小鼠黑色素毛囊、基底层黑素细胞数比较（个，±s，n＝12）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与紫草素低剂量组比较，△P＜0.05； 与紫草素中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别黑色素毛囊数基底层黑素细胞数对照组112.06±17.34143.37±20.02模型组38.52±6.12*58.86±8.78*紫草素低剂量组65.42±7.54＃80.92±10.61＃紫草素中剂量组85.23±10.07＃△107.75±12.07＃△紫草素高剂量组109.58±12.19＃△▲140.83±18.04＃△▲白癜风胶囊组108.06±11.94＃△▲138.96±17.47＃△▲

3.3 紫草素对白癜风小鼠血清α-MSH、TYR 水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠血清α-MSH、TYR 水平降低（P＜0.05）； 与模型组比较，紫草素各剂量组小鼠血清α-MSH、TYR 水平升高（P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与白癜风胶囊组比较，紫草素高剂量组小鼠血清α-MSH、TYR 水平无明显变化（P＞0.05），见表4。

表4 各组小鼠血清α-MSH、TYR 水平比较（μg/L，±s，n＝6）

表4 各组小鼠血清α-MSH、TYR 水平比较（μg/L，±s，n＝6）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与紫草素低剂量组比较，△P＜0.05； 与紫草素中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别α-MSHTYR对照组24.03±2.1092.67±7.08模型组13.95±1.02*60.02±3.42*紫草素低剂量组16.73±1.25＃70.43±4.10＃紫草素中剂量组20.44±1.46＃△81.98±4.23＃△紫草素高剂量组23.78±1.43＃△▲91.41±3.94＃△▲白癜风胶囊组23.57±1.50＃▲90.76±4.05＃△▲

3.4 紫草素对白癜风小鼠外周血Th17 细胞比例的影响 与对照组比较，模型组小鼠外周血Th17 细胞比例升高（P＜0.05）； 与模型组比较，紫草素各剂量组小鼠外周血Th17 细胞比例降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与白癜风胶囊组比较，紫草素高剂量组小鼠外周血Th17 细胞比例无明显变化（P＞0.05），见表5。

表5 各组小鼠外周血Th17 细胞比例比较（±s，n＝6）

表5 各组小鼠外周血Th17 细胞比例比较（±s，n＝6）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与紫草素低剂量组比较，△P＜0.05； 与紫草素中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别Th17 细胞比例/%对照组1.13±0.09模型组3.45±0.31*紫草素低剂量组2.76±0.28＃紫草素中剂量组1.98±0.20＃△紫草素高剂量组1.25±0.19＃△▲白癜风胶囊组1.30±0.13＃△▲

3.5 紫草素对白癜风小鼠血清IL-23、IL-17 水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠血清因子IL-23、IL-17 水平升高（P＜0.05）； 与模型组比较，紫草素各剂量组小鼠血清IL-23、IL-17 水平降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与白癜风胶囊组比较，紫草素高剂量组小鼠血清IL-23、IL-17水平无明显变化（P＞0.05），见表6。

表6 各组小鼠血清IL-23、IL-17 水平比较（ng/L，±s，n＝6）

表6 各组小鼠血清IL-23、IL-17 水平比较（ng/L，±s，n＝6）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与紫草素低剂量组比较，△P＜0.05； 与紫草素中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别IL-23IL-17对照组123.00±8.74112.16±9.05模型组273.51±21.23*227.38±15.81*紫草素低剂量组227.64±15.41＃190.95±12.63＃紫草素中剂量组187.21±10.73＃△154.72±10.78＃△紫草素高剂量组130.05±12.42＃△▲119.84±9.47＃△▲白癜风胶囊组134.58±11.92＃△▲122.91±10.04＃△▲

3.6 紫草素对白癜风小鼠皮肤组织IL-23、IL-17 mRNA 表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠皮肤组织IL-23、IL-17 mRNA 表达升高（P＜0.05）； 与模型组比较，紫草素各剂量组小鼠皮肤组织IL-23、IL-17 mRNA 表达降低（P＜0.05），并呈剂量依赖性； 与白癜风胶囊组比较，紫草素高剂量组小鼠皮肤组织IL-23、IL-17 mRNA 表达无明显变化（P＞0.05），见表7。

表7 各组小鼠皮肤组织IL-23、IL-17 mRNA 表达比较（±s，n＝12）

表7 各组小鼠皮肤组织IL-23、IL-17 mRNA 表达比较（±s，n＝12）

注： 与对照组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05； 与紫草素低剂量组比较，△P＜0.05； 与紫草素中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别IL-23/β-actinIL-17/β-actin对照组1.01±0.170.97±0.13模型组3.62±0.34*3.43±0.30*紫草素低剂量组2.75±0.27＃2.65±0.28＃紫草素中剂量组1.92±0.22＃△1.90±0.20＃△紫草素高剂量组1.10±0.19＃△▲1.09±0.16＃△▲白癜风胶囊组1.15±0.24＃△▲1.13±0.25＃△▲

4 讨论

目前白癜风发病机制还未得到明确阐释，研究者认为环境因素、遗传因素、外伤、心理因素、自身免疫失衡等均与白癜风发生有关。激素治疗、手术与激光治疗在临床得到广泛应用，但疗效并不显著，且费用高昂，副作用较多，因此探寻安全有效的治疗方法是临床迫切所需［13-14］。本实验通过背部脱毛区均匀涂抹2.5%氢醌软膏的方法构建白癜风模型小鼠，结果显示，建模小鼠皮肤组织表皮增生，涂药部位和非涂药部位毛发脱色评分、血清IL-23 及IL-17水平、皮肤组织IL-23 及IL-17 mRNA 表达升高，表明氢醌软膏可诱导促炎因子大量合成释放，引发炎症，造成毛发脱色。α-MSH 是垂体产生的一种激素，可促进黑素细胞产生黑色素，而TYR 是调控黑色素合成的关键酶，血清α-MSH、TYR 水平可反映黑素细胞功能［9，15］。本研究结果显示，模型小鼠黑色素毛囊及基底层黑素细胞数、血清α-MSH、TYR 水平降低，表明氢醌软膏可诱导黑素细胞死亡，破坏其功能。以上结果提示白癜风小鼠模型建立成功。

紫草素是提取自紫草的天然药物成分，还是治疗白癜风的中药制剂白癜风胶囊中含有的重要活性成分，可抑制促炎因子表达，促使抗炎因子表达，缓解人牙髓细胞炎症，对银屑病、白癜风等多种皮肤病具有较明显的治疗作用［7-8，16-17］。本实验结果显示，以不同剂量紫草素处理白癜风模型小鼠，能减轻小鼠皮肤组织表皮增生，降低涂药部位和非涂药部位毛发脱色评分、血清IL-23 及IL-17 水平，升高黑色素毛囊及基底层黑素细胞数、血清α-MSH 及TYR水平，且呈剂量依赖性，表明紫草素可抑制促炎因子表达合成，减轻炎症，缓解黑素细胞功能损伤，改善小鼠毛发脱色情况，且在一定剂量范围内，紫草素剂量越高，作用越强。

白癜风是一种自身免疫性炎症疾病，免疫细胞Th17 的激活分化与其发病过程密切相关。研究显示，白癜风患者体内Th17 细胞数量增加，皮肤组织Th17 细胞因子IL-17 水平也升高，IL-23 是调控Th17 细胞活化的重要炎性因子，能刺激Th17 细胞激活，促使其生成促炎因子IL-17，引发黑素细胞受损，导致白癜风，因而IL-23/Th17 轴可作为白癜风的一个防治靶点［3-6，18-20］。本实验结果显示，白癜风模型小鼠外周血中Th17 细胞比例、皮肤组织IL-23 及IL-17 mRNA 表达升高； 经紫草素给药后，其外周血中Th17 细胞比例、皮肤组织IL-23 及IL-17 mRNA 表达降低，表明IL-23/Th17 轴参与介导白癜风的发病过程，紫草素可阻止IL-23/Th17 通路激活，抑制免疫T 细胞向Th17 分化，降低炎性因子IL-23、IL-17 表达释放，减轻白癜风小鼠脱色症状。

综上所述，紫草素可下调IL-23、IL-17 表达，抑制免疫Th17 细胞活化，降低其比例，减轻黑素细胞炎症损伤，改善其功能，促进黑色素合成，缓解白癜风小鼠脱色症状，阻断IL-23/Th17 信号传导可能是其药理机制之一。但本实验未通过上调和下调该信号进行对照验证，后续会对其药理机制进行深入探讨。