基于网络药理学和动物实验探讨葛根芩连汤治疗2 型糖尿病的作用

范尧夫，许 娟，孙洪平，曹 琳

（南京中医药大学附属中西医结合医院内分泌科，江苏 南京 210028）

目前全球有超过4.63 亿糖尿病患者，到2045 年糖尿病患病人数将达到7 亿［1-2］。在糖尿病人群中，约90%以上为2 型糖尿病（T2DM），其主要病理特征是胰岛素抵抗及胰岛β 细胞功能障碍［3］。目前针对T2DM 的治疗主要以化学药物为主，虽然降糖疗效确切，但常伴随各种不良反应的发生。研究已证实，肝脏糖异生作用的增加是糖尿病发病机制中极为关键的一点，且该作用可贯穿T2DM 的整个病程。因此，调控肝脏异常糖异生作用，减少肝糖原输入是治疗T2DM 的重要且有前景的方法。近年来，中医药在改善糖脂代谢方面取得了显著成效。葛根芩连汤作为治疗早中期肠道湿热型T2DM 的代表方剂收录于《中国2 型糖尿病防治指南》［4］。葛根芩连汤出自《伤寒论》，具有清利湿热功效，在改善肝脏胰岛素抵抗、调节肝糖异生方面具有独特优势［5-6］，但是其治疗T2DM 的确切机制和靶点并不明确。本研究运用网络药理学及分子对接技术，构建“药物-靶点-通路” 多维网络，探讨葛根芩连汤治疗T2DM 的分子机制，并通过在体实验验证其可能机制，为葛根芩连汤改善糖脂代谢提供依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 葛根芩连汤有效成分、靶点筛选 利用中药系统药理学技术平台 （TCMSP），以药物口服生物利用度（OB） ≥30%、类药性（DL） ≥0.18 为筛选标准，获取葛根芩连汤有效成分，再借助Uniprot 数据库，将其信息转换为对应的靶标基因。

1.1.2 2 型糖尿病疾病相关靶点基因收集 以“type 2 diabetes mellitus” 为检索词，检索 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 数据库中T2DM 靶点基因，删除重复靶点，利用Uniprot 数据库进行人源基因转换。

1.1.3 葛根芩连汤有效成分、T2DM 共同靶点基因的筛选及韦恩图构建 运用Rx64 软件处理葛根芩连汤有效成分的靶点数据和T2DM 疾病靶点基因数据，然后进行匹配和交集基因筛选，绘制韦恩图。

1.1.4 有效成分-潜在作用靶点调控网络构建 采用Cytoscape 3.8.2 软件构建“活性成分-潜在作用靶点” 网络图，应用“Network Analysis” 功能对网络的拓扑属性进行分析，根据Degree 值筛选出具有核心调控作用的化合物。

1.1.5 靶蛋白相互作用 （PPI） 网络构建及核心靶点筛选 采用STRING （https： / /string-db.org） 在线数据库对药物-疾病共同靶点进行PPI 分析，物种定位为人，设定置信度阈值＞0.90，将筛选的蛋白导入Cytoscape 3.8.2 软件中构建PPI 网络，对节点连接度进行分析，筛选出核心靶点。

1.1.6 基因功能及生物通路富集分析 利用R 语言软件包对潜在靶基因进行基因本体（GO） 功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG） 富集分析，设定阈值P＜0.05。GO 分析中从生物过程（biological process，BP）、细胞组成 （cellular component，CC）、分子功能 （molecular function，MF） 3 个方面来探究潜在靶基因的功能水平，KEGG 分析中识别葛根芩连汤干预T2DM 的生物学通路，以揭示其对T2DM 的干预机制。

1.2 动物实验

1.2.1 动物 C57BL/6J 小鼠40 只，雄性，SPF 级，12 周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［实验动物生产许可证号SCXK （沪） 2012-0002］，饲养条件为相对湿度50% ～70%。所有实验涉及动物的饲养和实验过程均严格遵守南京中医药大学附属中西医结合医院实验动物管理与保护的相关准则。

1.2.2 药物 葛根、黄芩、黄连、甘草均购自南京中医药大学附属中西医结合医院，经江苏省中医药研究院中药制剂室吴军教授鉴定为正品，四者按8 ∶3 ∶3 ∶2 比例进行配制［5］，采用传统水煎法提取后浓缩至生药量1.56 g/mL，取部分浓缩液稀释至0.78 g/mL，分瓶保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.3 试剂与仪器 盐酸吡格列酮片（江苏德源药业股份有限公司，批号H20110048）。肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、白细胞介素17 （IL-17） ELISA 试剂盒和TNF-α、核因子κB （NF-κB）、β-actin 抗体 （英国Abcam 公司，批号ab46070、ab100702、ab215188、ab16502、ab6276 ）。Biospectrum 凝胶成像系统（美国UVP 公司）； 组织切片机（德国Leica 公司）； 光学显微镜（日本Olympus 公司）。

1.2.4 建模与给药 40 只小鼠适应性喂养1 周后随机分为正常组（8 只） 和造模组（32 只）。正常组给予普通饲料喂养，造模组给予高脂饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，批号2017416，含脂量60%） 喂养，4 周后腹腔注射1%链脲佐菌素溶液（45 mg/kg），持续3 d，注射后72 h，经尾静脉检测随机血糖≥16.7 mmol/L，即为造模成功。将造模组分为模型组、吡格列酮组和葛根芩连汤低、高剂量组，每组8 只，吡格列酮组灌胃吡格列酮30 mg/kg，葛根芩连汤低、高剂量组灌胃葛根芩连汤10、20 g/kg［5］，正常组和模型组灌胃等量蒸馏水，每天1 次，持续8 周，每周称量小鼠体质量以调整灌胃量。

1.2.5 指标检测 造模成功后，每周固定时间采大鼠尾静脉血，用血糖仪检测空腹血糖（FBG）。末次给药后小鼠禁食不禁水24 h，称量体质量，心脏采血后处死，全血离心后取血清，于-20 ℃下保存，根据ELISA 试剂盒说明书检测血清空腹胰岛素（FINS）、TNF-α、IL-17 水平； 采用稳态模型（HOMA） 评估胰岛素抵抗（IR） 数值，公式为HOMA-IR＝FBG×FINS/22.5。取各组大鼠肝组织，部分于10%福尔马林中固定，常规石蜡包埋、切片，HE 染色，部分冷冻保存，Western blot 法检测KEGG 富集核心通路中相关蛋白表达，匀浆后使用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，采用BCA 试剂盒测定浓度，进行10% SDS-PAGE 电泳，电转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育一抗、二抗，化学发光法曝光、显影，使用凝胶成像分析系统检测各蛋白条带灰度值。

1.2.6 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析； 不符合正态分布或方差不齐者采用非参数秩和检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根芩连汤有效成分及靶点筛选 葛根芩连汤化学成分共489 种，按OB≥30%、DL≥0.18 条件筛选后得到146种有效成分，其中葛根4 种，黄芩36 种，黄连14 种，甘草92 种，删除重复后共140 种，见表1。再使用Uniprot 数据库对上述有效成分对应的靶点进行人源基因转换，去重合并后得到212 个靶点。

表1 葛根芩连汤有效成分（OB 值前二十位）

2.2 药物-疾病共同靶点 将 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 数据库中10 821 个T2DM 靶标基因利用Venn 作图软件，得到204 个葛根芩连汤治疗T2DM 相关的潜在靶点，见图1。

图1 葛根芩连汤与T2DM 交集靶点Venn 图

2.3 PPI 网络构建与核心靶点 利用STRING 数据库和Cytoscape 软件，构建了包含204 个药物-疾病共同靶点的PPI 网络，见图2。采用网络拓扑结构筛选得到核心靶点18个，处于核心位置前十的关键靶点有JUN、AKT1、STAT3、MAPK3、FOS、MAPK1、MYC、MAPK14、ERS1、TP53，见图3。

图2 葛根芩连汤与T2DM 共同靶点PPI 网络

图3 PPI 核心靶点筛选流程图

2.4 “中药有效成分-靶点-疾病” 网络图构建 将葛根芩连汤的4 味中药、140 种有效成分、204 个潜在靶点采用Cytoscape 3.8.2 软件构建“中药有效成分-靶点-疾病” 可视化网络，通过“Network Analyzer” 功能对节点、边的数据进行拓扑分析，发现19 种活性成分的degree、BC、CC 均高于平均值，其中排名前三的为槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、汉黄芩素（wogonin），见图4。

图4 “中药有效成分-靶点-疾病” 可视化网络图

2.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 将药物-疾病共同靶点经R 语言处理后进行GO 功能、KEGG 通路富集分析。选取BP、CC、MF 显著性排名前十者构成GO 富集气泡图。GO-BP 主要涉及对药物的反应、细胞对化学应激的反应、对金属离子的反应等，GO-CC 主要涉及膜筏、膜微区、膜区等，GO-MF 主要涉及DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异的DNA 结合转录因子结合、酰胺结合等，见图5。对药物-疾病共同靶点进行KEGG 通路富集分析，共得到119 条信号通路，选取排名前二十者绘制气泡图，进行可视化分析，见图6。进一步对GO 生物过程和KEGG 通路按照P值筛选分析，结果显示，TNF 通路中的PI3K/p-AKT/p-IKKs/NF-κB 通路在T2DM 的发生和发展过程中起着重要作用，见图7。

图5 葛根芩连汤治疗T2DM 的GO 功能富集分析

图6 葛根芩连汤治疗T2DM 的KEGG 通路分析

图7 TNF 通路过程分析

2.6 葛根芩连汤对T2DM 小鼠体质量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠体质量增加 （P＜0.01），FBG、FINS 及HOMA-IR 水平均升高（P＜0.01）； 与模型组比较，各给药组小鼠体质量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平均降低 （P＜0.05，P＜0.01），见图8。

图8 各组小鼠体质量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平变化（±s，n＝8）

2.7 葛根芩连汤对T2DM 小鼠肝组织病理形态的影响 与正常组比较，模型组小鼠可见肝细胞结构不规则，肝脏脂质沉积、空泡变性及水样变性； 与模型组比较，各给药组小鼠肝细胞结构稍肿大，呈放射状排列，肝脏组织形态学紊乱减轻，可见散在脂肪空泡，边界稍模糊，见图9。

图9 各组小鼠肝组织HE 染色（×400）

2.8 葛根芩连汤对T2DM 小鼠血清TNF-α、IL-17 水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-17 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，各给药组小鼠血清TNF-α、IL-17 水平降低（P＜0.01），见表2。

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-17 水平比较（±s，n＝8）

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-17 水平比较（±s，n＝8）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别IL-17/（pg·mL-1）TNF-α/（ng·L-1）正常组58.04±8.2626.45±2.51模型组103.59±14.02**58.19±7.82**吡格列酮组65.37±9.45＃＃32.27±4.43＃＃葛根芩连汤低剂量组66.78±10.26＃＃31.25±4.60＃＃葛根芩连汤高剂量组62.31±8.62＃＃28.96±2.67＃＃

2.9 葛根芩连汤对T2DM 小鼠肝组织TNF-α、NF-κB 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝组织TNF-α、NF-κB 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，各给药组小鼠肝组织TNF-α、NF-κB 蛋白表达降低（P＜0.01），见图10。

图10 各组小鼠肝组织TNF-α、NF-κB 蛋白表达变化（±s，n＝8）

3 讨论

越来越多研究证实，葛根芩连汤治疗T2DM 疗效确切［7-11］。《中国2 型糖尿病防治指南（2017 年版） 》 推荐葛根芩连汤用于治疗早、中期肠道湿热证T2DM［4］。然而，中药复方的物质基础十分复杂，这导致了其作用机制研究的不明确性。近年来，网络药理学的兴起为中药复方的研究提供了新的方法和思路，也为更好地理解中药复方的药效和疗效机制提供了新的途径。

本研究通过数据库筛选，最终获得葛根芩连汤140 种有效成分和212 个对应药物靶点。采用Venn 分析后得到204 个交集靶点； 通过构建PPI 网络及网络拓扑结构筛选出关键基因18 个。根据degree 值筛选前3 位有效成分为槲皮素、山柰酚、汉黄芩素。这3 种成分均属于黄酮类化合物，可以提高胰岛素敏感性和改善胰岛β 细胞数目［12-15］。我国一项大型横断面研究显示槲皮素摄入量与T2DM 的患病率呈负相关［12］。槲皮素是一种天然多羟基黄酮类化合物，可以降低机体氧化应激水平，抑制INS-1 细胞凋亡，促进胰岛素分泌［13］。山柰酚可以增加Akt 和己糖激酶活性，降低肝脏中葡萄糖-6 磷酸酶的活性，并通过抑制肝脏中的糖异生发挥降糖作用［16］。汉黄芩素可通过胰岛素受体-1/PI3K/碱性磷酸酶途径促进葡萄糖摄取和糖酵解，抑制肝细胞糖异生，改善胰岛素抵抗［17］。上述研究表明，葛根芩连汤可能这3 种有效成分作用于关键靶蛋白来发挥治疗T2DM 的作用。

GO 分析表明葛根芩连汤可能作用于多细胞组分产生不同生物学功能，从而发挥治疗T2DM 的功效。KEGG 富集分析结果显示葛根芩连汤治疗T2DM 的关键靶点主要参与TNF 信号通路等。随着T2DM 发病机制的深入研究，很多学者认为T2DM 可能是一种免疫性的炎性反应性疾病，其中TNF-α 参与炎症反应及糖脂代谢的调节［18-20］。Skuratovskaia 等［21］发现，TNF-α 可以抑制胰岛素受体底物-1的磷酸化进而导致胰岛素抵抗的发生，增加T2DM 病程的进展。另外研究表明，TNF-α 可以导致血管内皮细胞的炎症反应，增加内皮细胞的粘附性，使血管内皮屏障功能受损； 此外，TNF-α 还可以促进血管内皮细胞的凋亡，导致内皮细胞的损伤和脱落，从而增加糖尿病血管病变的发生风险［22］。以上研究均表明，TNF-α 信号通路在T2DM 中发挥重要作用。

为了验证网络药理学预测结果，动物实验结果发现，葛根芩连汤可以有效降低T2DM 小鼠胰岛素、HOMA-IR、TNF-α 及IL-17 水平，改善高血糖状态； 减少肝细胞内的脂滴积聚，有助于维持肝细胞的正常结构和功能； 降低肝组织TNF-α、NF-κB 蛋白表达。本研究发现网络药理学预测的药物作用靶点与实际药物作用靶点有较高的一致性，表明网络药理学方法可以较准确地预测药物与疾病靶点的相互作用关系。

综上所述，葛根芩连汤治疗T2DM 具有多成分、多靶点特性，其可能通过TNF-α 信号通路抑制炎症反应发挥降糖疗效，这将为进一步研究葛根芩连汤治疗T2DM 的基础研究提供一定的理论依据。