基于网络药理学和分子对接研究华蟾素治疗胃癌的作用机制

李时超，陈 腾，秦凤凤，陈 超，李五生，王 杰*

（1.上海中医药大学附属普陀医院，上海 200062； 2.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；3.安徽医科大学上海普陀中心临床学院，上海 200062； 4.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610075）

胃癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤，虽然在全球范围内其发病率有所下降，位居恶性肿瘤的第6 位，但是其死亡率却位居第3 位［1］。我国是胃癌的高发地区，其发病率和死亡率居恶性肿瘤的第2 位［2］。胃癌的治疗是以手术为主，辅以化疗、放疗等综合治疗。中医药是胃癌防治中重要的组成部分，在癌前病变的预防，延长患者生存期，减轻化疗不良反应等方面有一定的优势［3］。

华蟾素是蟾酥的提取物，可用于治疗胃癌，研究显示，华蟾素能提高晚期胃癌化疗的反应率和疾病控制率，改善晚期胃癌患者的生活质量［4］，但是由于华蟾素有效成分比较复杂，进一步对其有效成分和作用机制的研究是促进华蟾素临床应用的基础。

网络药理学是基于系统生物学和生物信息学，通过将药物、靶点、疾病靶基因交集在具有多层次交互作用的生物网络系统中的一门新学科［5］。分子对接是基于计算机模拟结构的方法，通过对接的手段在分子水平上预测配体-受体的相互作用，或评估构效关系，以识别具有治疗意义的化合物的一项新技术［6］。本研究拟通过网络药理学和分子对接的方法，研究华蟾素治疗胃癌的分子机制和物质基础，为临床应用华蟾素辅助治疗胃癌提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 华蟾素成分筛选及预测靶点获取 检索PubMed、CNKI、万方、VIP 数据库得到华蟾素抗肿瘤的主要物质，检索PubChem 数据库 （http： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 获取华蟾素成分的分子结构及Canonical SMILES 号，通过 SwissTargetPrediction （ http： / /swisstargetprediction.ch/）、PharmMapper （http： / /lilab-ecust.cn/pharmmapp）、TargetNet （http： / /targetnet.scbdd.com/homeer） 网站预测华蟾素成分靶点，采用UniProt Knowledgebase （UniProtKB，http： / /www.uniprot.org/） 校 正 后，以 SwissTarget Prediction Prob ≥ 0.10、TargetNet Prob ≥ 0.60 或PharmMapper Fit≥0.60 为条件筛选预测靶点。

1.2 胃癌疾病基因获取 以“gastric cancer” 为关键词，种属限定为“Homosapiens”，搜索治疗目标数据库（TTD，http： / /bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd）、在线孟德尔人类遗传数据库 （ OMIM，http： / /www.omim.org/）、DisGeNET 数 据 库 （ http： / /www.disgenet.org ）、GeneCards 数据库 （https： / /www.genecards.org/），以GeneCards 得分≥10 分、DisGeNET≥0.10 为筛选条件，删除重复基因，得到胃癌疾病基因。

1.3 药物-疾病共同靶点及其蛋白相互作用网络构建 通过R 软件将华蟾素主要成分的预测靶点与胃癌疾病基因取交集，得到药物-疾病共同靶点。通过String 平台构建药物-疾病共同靶点的蛋白相互作用（PPI） 网络，将蛋白种类设置为 “Homosapines”，最低相互作用阈值设为中等“medium confidence” （0.4），其他为默认设置。然后下载tsv 格式文件，导入Cytoscape 3.7.2 软件，并根据网络节点度值来评价主要靶点，每个节点代表1 个基因，度值与节点相连节点的数量相关，度值越大，节点在网络中越重要。

表1 华蟾素主要成分信息

1.4 华蟾素-胃癌共同靶点生物功能和通路分析 采用ClusterProfiler R 软件对华蟾素-胃癌共同靶点进行基因本体（GO） 功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG） 的通路富集分析。

1.5 药物-靶点-疾病相互作用网络构建 将华蟾素与胃癌共同靶点PPI 的tsv 格式文件导入Cytoscape 软件中，构建药物-靶点-疾病可视化的网络模型，网络中的节点代表药物成分、疾病靶基因，通过度值筛选华蟾素治疗胃癌的关键成分和靶点。

1.6 关键靶点与胃癌预后的相关性 通过Kaplan-Meier 在线网站（http： /kmplot.com/analysis/） 选择胃腺癌数据库，输入筛选出的关键靶点，得到与胃癌总体生存期相关的风险比（HR） 和log rank 检验的P值，P＜0.05 表示该靶点与胃癌的临床预后风险密切相关。

1.7 华蟾素主要成分与关键靶点分子对接 从PubChem数据库（https： / /pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下载配体化合物的3D 结构并转换格式，从PDB 数据库（https： / /www.rcsb.org/） 中下载受体蛋白3D 结构，采用Pymol 软件对蛋白质进行去水、加氢等操作，Auto Dock软件将化合物及靶蛋转换为*pdbqt 格式，Vina 软件进行分子对接，Pymol 软件分析配体和受体的相互作用。

1.8 核心靶点与胃癌临床预后风险的单因素、多因素Cox回归分析 通过网络药理学、分子对接、临床预后数据库结果筛选出核心基因靶点，通过R 语言中的survival 包在TCGA、GEO （GSE15459） 胃癌数据库中进行单因素Cox回归分析，在TCGA 数据库中将筛选出的核心基因靶点通过R 语言中的survival 包进行多因素Cox 回归分析，构建预后风险评分模型，以评价核心靶点与胃癌临床风险预后的关系。再计算风险评分，公式为风险评分＝基因1 表达量×多因素Cox 回归系1＋…＋基因N表达量×多因素Cox 回归系数N（其中N代表基因数），计算每例患者的风险评分，通过survival 包中的surv_ cutpoint 函数计算cutoff 值，将患者划分为高风险组和低风险组，采用R 语言中的survminer包绘制Kaplan-Meier （KM） 生存曲线，计算2 组患者的生存率以评价模型性能。

2 结果

2.1 华蟾素主要成分及其预测靶点 参考文献［7-8］ 报道，蟾毒内酯类、吲哚生物碱类为华蟾素抗肿瘤的主要活性成分，将这2 类成分所含的化合物通过检索PubChem 数据库得到含有分子结构的化合物28 个，其中蟾毒内酯类有20 个，分别为华蟾毒它灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、远华蟾蜍精、日蟾蜍他灵、沙蟾毒精、蟾毒灵、蟾蜍他灵、伪异沙蟾毒精、resibufaginol、脂蟾蜍精、去乙酰华蟾蜍精、华蟾蜍毒醇、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵宁、海蟾蜍精、19-羟基蟾毒灵、嚏根草醇、蟾蜍它里定、伪异沙蟾毒精；吲哚生物碱类有8 个，分别为蟾蜍硫堇、蟾蜍特尼定、蟾毒色胺、五羟色胺、脱氢蟾蜍色胺、N-乙酰羟色胺、5-羟基吲哚-3-甲醛、蟾蜍色胺C，具体见表1。按筛选条件将各数据库预测靶点汇总，去重后得到484 个华蟾素主要成分的预测靶点。

2.2 胃癌疾病靶点 按筛选条件，得到各数据库靶点为TTD 数据库41 个、OMIM 数据库484 个、DisGeNET 数据库290 个、GeneCards 数据库311 个，删除重复基因后得到胃癌疾病基因981 个。

2.3 药物-疾病共同靶点及其PPI 网络 将华蟾素主要成分的预测靶点与胃癌疾病基因取交集，得到两者共同靶点70 个。通过String 平台和Cytoscape 3.7.2 软件得到70 个药物-疾病共同靶点的PPI 网络图，见图1～2。PPI 网络图中，SRC （度值50）、CTNNB1 （度值48）、MAPK1 （度值47）、MAPK3 （度值47）、STAT3 （度值46）、EGFR （度值44）、ALB （度值43）、MTOR （度值42）、ESR1 （度值41）、IL6（度值40） 是度值靠前的节点，可能为华蟾素治疗胃癌的主要靶点。

图1 华蟾素与胃癌共同靶点PPI 网络

图2 华蟾素与胃癌共同靶点（排名前20 位）

2.4 华蟾素-胃癌共同靶点GO 生物功能分析 华蟾素治疗胃癌的靶点影响了1 399 个生物学过程、75 个分子功能，生物过程主要包括肽基丝氨酸磷酸化、肽基丝氨酸修饰、对氧化应激的反应、蛋白激酶B 信号传导、细胞对氧化应激的反应、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰、对活性氧的反应等，分子功能主要包括蛋白质酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性、组蛋白激酶活性、核受体活性等。排名前二十的生物过程、分子功能富集结果见图3～4。

图3 华蟾素与胃癌共同靶蛋白涉及的生物过程GO 富集分析

图4 华蟾素与胃癌共同靶蛋白涉及的分子功能GO 富集分析

2.5 华蟾素-胃癌共同靶点的KEGG 通路富集分析 共得到145 条信号通路，P值排名前20 位的见图5，主要包括EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、前列腺癌、内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖、胃癌、ErbB 信号通路、乳腺癌、神经胶细胞瘤等。

图5 华蟾素与胃癌共同靶蛋白KEGG 富集分析（排名前20 位）

2.6 构建药物-靶点-疾病相互作用网络 由图6 可知，华蟾素治疗胃癌的主要化合物是华蟾毒它灵（度值15）、蟾毒它灵（度值12）、华蟾酥毒基（度值8）、蟾蜍色胺C（度值8）、蟾毒灵（度值6），关键靶点有SRC （度值51）、CTNNB1 （度值49）、MAPK1 （度值48）、MAPK3 （度值48）、STAT3 （度值47）、EGFR （度值45）、ALB （度值44）、ESR1 （度值43）、MTOR （度值42）、IL6 （度值41）。

图6 华蟾素-靶点-胃癌相互作用网络图

2.7 关键靶点与胃癌预后的相关性 结果见表2、图7A～7B，可知SRC、CTNNB1、MAPK1、MAPK3、EGFR、ALB、ESR1 的log rank 检验P＜0.05，表明这些靶点与胃癌总体生存期存在明显相关性，也与胃癌的临床预后风险密切相关。

图7 部分核心靶点与胃癌预后的相关性及与resibufaginol 的分子对接图

表2 关键靶点与胃癌总体生存期的相关性

2.8 华蟾素主要成分与关键靶点的分子对接 分子对接结合能小于0，表示配体与受体可自发结合，并且当结合能≤-5.0 kJ/mol 时，小分子配体与受体结合较好［9］。将华蟾素主要成分分别与 SRC、CTNNB1、MAPK1、MAPK3、STAT3、EGFR、ALB、MTOR、ESR1、IL6 进行分子对接，发现其结合能大多小于等于-5.0 kJ/mol，见图7C～7D、图8，说明华蟾素主要成分与胃癌关键靶点间有较好的结合活性，其中所有关键靶点与华蟾素主要成分resibufaginol（-112.4 kJ/mol）、华蟾酥毒基（-81.9 kJ/mol）、伪异沙蟾毒精（-79.9 kJ/mol）、沙蟾毒精（-79.7 kJ/mol）、华蟾蜍毒醇（-79.3 kJ/mol） 结合能较好，华蟾素主要与关键靶点EGFR （- 143.0 kJ/mol）、MTOR （-139.8 kJ/mol）、MAPK3 （-139.3 kJ/mol）、ALB （-137.9 kJ/mol）、STAT3（-136.3 kJ/mol） 结合能较好，表明这些靶点与华蟾素的主要成分更容易结合。结合“2.7” 项下结果可知，这些靶点中EGFR、MAPK3、ALB 与胃癌预后密切相关，推测三者可能是华蟾素治疗胃癌的核心靶点。

图8 华蟾素主要成分与关键靶点的分子对接热图

2.9 核心靶点与胃癌临床预后风险的单因素、多因素Cox回归分析 对筛选出的3 个核心基因靶点 （EGFR、MAPK3、ALB） 进行单因素Cox 回归分析，发现在TCGA数据库中核心靶点EGFR、ALB 与胃癌临床预后风险有关，在GEO 数据库中核心靶点MAPK3 与胃癌临床预后风险有关，具体见表3。在TCGA 数据库中对3 个核心基因靶点进行多因素Cox 回归分析，得到胃癌预后风险评分模型，计算风险评分，公式为风险评分＝EGFR 表达值×0.153 ＋MAPK3 表达值× （-0.067 2） ＋ALB 表达值×0.09，对每例胃癌患者进行风险评分，通过surv_ cutpoint 函数计算出cutoff 值为0.285 197 9，并据此分为高风险组（96 例） 和低风险组（292 例）。KM 分析结果显示，与低风险组比较，高风险组患者总体生存率更低（P＜0.01），表明华蟾素治疗胃癌的3 个核心靶点与胃癌临床预后密切相关，见图9。

图9 核心靶点与胃癌临床预后风险的多因素Cox 回归分析

表3 核心靶点与胃癌临床预后风险的单因素Cox 回归分析

3 讨论

中医药在肿瘤防治中的作用越来越引起人们的重视，但由于中医药成分的复杂性和作用机制的不确定性，阻碍了中医药在肿瘤疾病中的广泛应用［10］。网络药理学从整体的角度阐明中医药的作用机制和作用成分，有利于中医药的现代化研究［11］。胃癌属中医“噎膈” “胃返” “积聚”等范畴，病机以正虚为本、癌毒为标，而癌毒蕴结于胃是其发病的关键，癌毒不除，疾病难愈［12］。《金匮要略心典》曰： “毒者，邪气蕴蓄不解之谓”，因此癌毒致病，法当解毒。而华蟾素具有解毒、消肿、止痛之功，在胃癌的辅助治疗中具有良好的疗效。

本研究显示，华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍色胺C、蟾毒灵是华蟾素治疗胃癌的关键成分，除蟾蜍色胺C 外都是华蟾素的主要成分之一，这些关键成分在多种肿瘤的治疗中显示多重作用。研究表明，华蟾毒它灵增加耐药肿瘤细胞对顺铂的敏感性［13］。蟾毒它灵能促进黑色素瘤［14］和食道癌［15］细胞的凋亡，抑制肿瘤的增殖。华蟾素主要成分的华蟾酥毒基的作用较为广泛，可以通过抑制自噬增加胃癌细胞的凋亡［16］，对乳腺癌细胞具有抗增殖和促凋亡作用［17］，抑制肠癌的血管生成［18］、逆转P-gp 介导的肠癌多药耐药性［19］。蟾蜍色胺C 是一种新型的吲哚类生物碱，有研究显示它对肺癌A549 细胞的毒性强于5-FU［20］。蟾毒灵是华蟾素成分中研究最热门的物质，在胃癌中蟾毒灵能通过下调Wnt/ASCL2 表达来抑制胃癌的侵袭和转移［21］，逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性［22］，抑制保护性自噬发挥抗胃癌作用［23］。

本研究筛选出了华蟾素治疗胃癌的核心靶点是EGFR、MAPK3 （又称ERK1）、ALB，相关文献也证实了筛选结果。另外，华蟾素的关键成分蟾毒灵能通过EGFR/AKT/ERK 信号通路抑制卵巢癌细胞的增殖［24］； 蟾毒灵可通过调节胃癌细胞中的ERK 信号通路来发挥抗癌作用［23］； 蟾毒灵可通过调节肝癌细胞中ALB 和AFP 的表达来逆转细胞的恶性表型并促进其分化和成熟［25］。

本研究中华蟾素抗胃癌涉及的KEGG 核心通路是EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路，富集了最多的靶点。在筛选出华蟾素治疗胃癌的关键靶点中，SRC、MAPK1、MAPK3、STAT3、EGFR、mTOR 与核心通路EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药通路相关，华蟾素及其主要成分对核心通路中的这些靶点的作用都有相关研究报道。其有效成分蟾毒灵是SRC-3 和SRC-1 的有效小分子抑制剂［26］，能够抑制EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路的激活； 华蟾素可以通过抑制c-Met/ERK 信号通路的上皮间质转化来阻止肝癌HepG2 细胞迁移和侵袭［27］； 华蟾酥毒基可通过阻断IL-6/STAT3 信号通路抑制骨肉瘤细胞的活力和成瘤能力［28］； 蟾毒灵可通过靶向mTOR/HIF-α 途径抑制卵巢癌增殖和迁移［29］。

综上所述，华蟾素治疗胃癌的关键成分为华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾酥毒基、蟾蜍色胺C、蟾毒灵，可能通过调控EGFR、MAPK3、ALB、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖等多靶点、多途径发挥对胃癌的治疗作用，以期为进一步的临床或实验研究提供科学依据和研究思路。