基于HPLC-Q-TOF-MS、指纹图谱和含量测定的精气神口服液质量评价研究

郑超,石德志,汤志锋,张云羽,钟绍辉,肖莲莲,刘华兰,廖楠汐,嵇晶,郑云枫,程建明

(南京中医药大学药学院,江苏省经典名方工程研究中心,江苏 南京 210023)

精气神口服液由黄精、人参、大枣、酸枣仁、莲子5味药食同源类中药再加入小分子肽组成,用于快速恢复体力,益气固本,宁心安神。研究表明:黄精[1-3]、人参[4-6]、大枣[7-8]均富含多糖和皂苷类成分,可以缓解身体疲劳,侧重于补气;而酸枣仁[9]和莲子[10]侧重于安神;小分子肽除本身具有抗疲劳功能之外,还可以发挥载体的作用,将中药中的各种营养物质载在自己的本体上,输送到机体所需部位,被机体更好地吸收,以满足机体所需[11]。

质量控制是确保药食同源食品安全有效的核心环节,然而,目前存在研究内容不全[12]、评价指标缺乏功能针对性[13]等问题,限制了药食同源食品的精准化与多样化发展[14]。为完善药食同源食品质量控制研究的不足,有研究策略指出药食同源食品应兼具食品和中药双重属性,可以在食品属性评价的基础上进行中药属性评价,并创新性地将药食同源食品的中药属性评价分为质控性评价和功能性评价[15]。其中,质控性评价是对药食同源食品中质控性成分的检测,检测指标包括药典检测成分、指纹图谱、特征图谱及质量标志物,用于确定药食同源食品中原料中药的真伪优劣,防止非法添加和替代;功能性评价则是通过对中药类保健食品中功能性指标成分的含量检测,评价其有效性[14]。本研究在此基础上,通过HPLC-Q-TOF-MS技术分析精气神口服液的化学成分组成,并建立指纹图谱和含量测定同时测定的方法,为精气神口服液的质量控制和产品开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪、蒸发光散射检测器(美国Agilent公司),BT125D型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司),HPLC-Q-TOF-MS型质谱仪(Analyst1.6色谱工作站和Peak View等质谱分析软件),KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

黄精(批号:220403)、人参(批号:220305)、大枣(批号:220404)、酸枣仁(批号:220412)、莲子(批号:220413)购自南京仙林泰康鼓楼医院药房,所有药材由南京中医药大学药学院严辉副教授鉴定。大豆肽粉(批号:20211204-1)购自辽宁太爱肽生物工程技术有限公司。人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg3、酸枣仁皂苷A、斯皮诺素对照品(中国食品药品检定研究院,批号:110703-202034、110754-202028、110704-202129、111818-202104、111719-201806、110804-201504、110734-201914、111869-202005,纯度:94.0%、93.9%、94.3%、97.3%、96.8%、99.5%、96.0%、94.8%);精气神口服液(S1～S10,批号:20230511、20230512、20230513、20230514、20230515、20230516、20230517、20230518、20230519、20230520,规格:30 mL·袋-1,实验室自制)。甲醇、乙腈(美国TEDIA公司),以上试剂均为色谱纯;水为超纯水(Unique-R10多功能超纯水系统制备)。

2 方法与结果

2.1 HPLC-Q-TOF-MS成分分析

2.1.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0～30 min,15%～23%A;30～40 min,23%～29%A;40～75 min,29%～53%A;75～80 min,53%～70%A),柱温30 ℃,流速1.0 mL·min-1,蒸发光散射检测器(ELSD)蒸发温度为90 ℃,气体流量为1.6 L·min-1。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI),采用正负离子扫描检测,质量扫描范围m/z50～1 500;喷雾电压45 kV;雾化气压力60 psi;辅助气压力60 psi;气帘气压力40 psi;离子源温度600 ℃;锥孔电压100 V;碰撞空射出电压40 eV。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密吸取精气神口服液20 mL,水饱和正丁醇萃取3次(每次20 mL),合并正丁醇萃取液,用2%NaOH碱洗2次,每次50 mL,再用蒸馏水50 mL洗2次,弃去水液,正丁醇层置水浴锅上蒸干,残渣加甲醇溶解至5 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,即得。

2.1.4 精气神口服液化学成分分析 使用上述色谱、质谱条件对供试品溶液进行正、负离子全扫描,获得正、负离子模式下的总离子流图(Total ion chromatogram,TIC图),见图1。将数据导入PeakView软件,从精气神口服液中共鉴别了75个化合物,具体见表1[16-20]。

通过HPLC-Q-TOF-MS分析鉴别出75个化合物,包括黄酮类、皂苷类、萜类、脂肪酸类、生物碱类等,对其药味来源进行归属,其中29个源自黄精,21个源自人参,16个源自酸枣仁,9个源自大枣,3个源自莲子,6个源自大豆肽,化合物1为黄精、大豆肽共有成分,化合物2、5和27为黄精、大枣共有成分,化合物4、8为莲子、大豆肽共有成分,化合物40、42为黄精、人参共有成分,化合物57为酸枣仁、大枣共有成分。

2.2 指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件 同“2.1.1”项下色谱条件。

2.2.2 供试品溶液的制备 同“2.1.3”项下供试品溶液的制备。

2.2.3 对照品溶液的制备 取酸枣仁皂苷A、斯皮诺素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg3对照品适量,精密称定,加甲醇制成质量浓度分别为0.155、0.257、0.220、0.223、0.241、0.232、0.175、0.297 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.4 各单味药供试品溶液的制备 分别称取处方中每服剂量所需相应饮片的量(S1中各批次单味药)按照“2.1.3”项下方法制备,得单味药供试品溶液。

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 精密度试验 取“2.1.3”项下制备供试品溶液,色谱条件同“2.1.1”,连续进样6针,以人参皂苷Rg3色谱峰为参照峰(S),计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值,各共有峰相对保留时间RSD小于1%,相对峰面积RSD小于5%,表明仪器精密度良好。

2.2.5.2 重复性试验 取每服饮片量,按照“2.1.3”项下制备得6份供试品溶液,按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析,以人参皂苷Rg3色谱峰为参照峰(S),计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值,各共有峰相对保留时间RSD小于1%,相对峰面积RSD小于5%,表明重复性良好。

2.2.5.3 稳定性考察 取同一批供试品溶液,按照“2.1.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、24 h进样测定,以人参皂苷Rg3色谱峰为参照峰(S),计算各共有峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值,各共有峰相对保留时间RSD小于1%,相对峰面积RSD小于5%,表明样品在24 h内稳定。

2.2.6 精气神口服液指纹图谱的建立及相似度评价 按照“2.1.1”项的指纹图谱条件,按照“2.1.3”项的方法制备S1～S10供试品溶液,并进行HPLC-ELSD测定,得到10批精气神口服液HPLC-ELSD指纹图谱。将10批精气神口服液指纹图谱依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012A版)软件,以S1为参照图谱,采用“中位数”法生成,使用多点校正对色谱峰进行匹配,标注14个共有峰,生成样品叠加图谱及对照指纹图谱,计算相似度,10批样品指纹图谱的相似度均大于0.950。指纹图谱(R)和10批样品叠加图谱(S1～S10)见图2。

图2 精气神口服液对照指纹图谱(R)及10批精气神口服液叠加图谱(S1～S10)

2.2.7 指纹图谱峰指认及峰归属 将指纹图谱与混合对照品溶液、单味药材供试品溶液进行比对,指认出8个色谱峰(图3),并对14个共有峰进行归属(图4),其中12个峰来源于人参(2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14),2个峰来源于酸枣仁(1、9),1个峰来源于黄精(6),大枣、莲子尚无共有峰归属,其余药味均有归属。

注:1.斯皮诺素;2.人参皂苷Rg1;3.人参皂苷Re;5.人参皂苷Rf;6.人参皂苷Rb1;9.酸枣仁皂苷A;10.人参皂苷Rd;13.人参皂苷Rg3

注:1.全方;2.黄精;3.人参;4.大枣;5.酸枣仁;6.莲子

2.2.8 参照峰的选择及相对保留时间的计算 综合10批样品保留时间结果,详见表2,确定了精气神口服液的鉴别标准,其指纹图谱中应有14个共有峰,并以人参皂苷Rg3(13号峰)作为参照峰(S峰),计算各共有峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间偏差应在规定值的±10%之内。规定值为:0.261(峰1)、0.532(峰2)、0.537(峰3)、0.673(峰4)、0.689(峰5)、0.736(峰6)、0.742(峰7)、0.749(峰8)、0.753(峰9)、0.810(峰10)、0.842(峰11)、0.925(峰12)、1.000(峰13)、1.010(峰14)。本方皂苷类成分较多,不同批次和来源饮片之间存在较大差异,相对峰面积RSD值相对偏高,峰1(斯皮诺素)相对峰面积大于30%,其他峰的相对峰面积均小于30%,见表3。确定药材产地、批次以及具体炮制方法后,可全面把控全方的整体质量,缩小批次间差异。

2.3 含量测定

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.3”项下对照品溶液配制成系列浓度的对照品溶液,按照2.1.1项下色谱条件对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和斯皮诺素4个成分进行含量测定。以进样量的对数值为横坐标,峰面积的对数值为纵坐标,绘制标准曲线,得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及斯皮诺素回归方程以及线性范围,见表4。

表4 标准曲线及线性范围

2.3.2 精密度试验 取“2.1.3”项下制备供试品溶液,按上述色谱条件连续进样测定6次,计算得到4种成分峰面积的RSD均小于5%,表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取每服饮片量,按照“2.1.3”项下制备得6份供试品溶液,按上述色谱条件进样测定,计算得到4种成分峰面积的RSD均小于5%,表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批供试品溶液,同“2.1.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、16、24 h进样测定,计算得到4种成分峰面积的RSD均小于5%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收试验 取已知含量的同一批样品6份,分别精密加入人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及斯皮诺素对照品,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,测定含量,并计算加样回收率及RSD。人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及斯皮诺素的平均加样回收率分别为102.4%、103.4%、101.6%、101.8%,RSD分别为3.4%、2.7%、0.9%、1.4%。

2.3.6 含量测定 取10批精气神口服液样品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样测定,结果见表5。考虑到不同批次的含量差异以及未来药材均一化投料要求,按-20%制定含量下限,规定:本品含人参皂苷Rg1不得少于4.013 mg,人参皂苷Re不得少于26.170 mg,人参皂苷Rb1不得少于37.471 mg,斯皮诺素不得少于9.309 mg。

表5 精气神口服液含量测定(mg,n=6)

3 讨论

3.1 样品前处理方法的选择

鉴于中药复方传统水煎用药,其复杂成分严重干扰对目标活性成分的研究,因而本研究对不同样品前处理方法进行考察,从而降低背景干扰。考虑到精气神口服液中的主要成分集中在皂苷类,故分别采用正丁醇萃取、乙酸乙酯萃取、大孔树脂纯化的方法对样品进行处理,通过HPLC-ELSD对分析物峰面积和其他干扰组分进行分析,发现正丁醇液效果更好,推测正丁醇萃取可以去除复杂样品中基质的干扰,使相应特征性化合物峰面积增高。因此,选择正丁醇萃取作为最优前处理方法进行后续研究。

3.2 色谱条件的优化

考察了不同流动相(乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%醋酸水),不同色谱柱(Agilent HC C18、Agilent TC C18、Agilent ZORBAX SB C18、Hedera ODS-2)对洗脱效果的影响,最终确定了指纹图谱的最佳条件。在梯度洗脱过程中发现人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分离度不是很理想,考虑到两者化合物母核极为相似,保留时间的变化实际上是糖单元的数量带来的氢键效应以及糖单元引入体积变化的综合结果。在《中国药典》2020年版人参含量测定项的方法基础上进行优化,最终确定80 min为本品各成分的有效分离保留时间。

3.3 活性成分含量测定

基于精气神口服液活性成分的多样性和复杂性,采用单一成分含量测定难以评价与控制其质量,故考虑多活性成分含量测定来全面评价其质量。在指纹图谱建立过程中,发现人参皂苷Rg3的响应值最高,而人参皂苷Rg1却很低,在前期对人参单味药进行质量检验时,发现其人参皂苷Rg1与人参皂苷Rg3含量相差不大,因此推断在样品处理过程中人参皂苷Rg1可能发生了转化。在选取含量测定指标时,因《中国药典》2020年版中人参的含量测定项是人参皂苷Rg1,故没有选择响应最高的Rg3作为含量测定指标。鉴于人参、酸枣仁、黄精为精气神口服液的主要药味,结合前期峰归属,最终选择斯皮诺素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb14个活性成分,进行含量测定。但本研究的指纹图谱和含量测定方法主要关注了黄酮类和皂苷类成分,而复方中多糖含量也较多,因此后续对于不同活性成分的药效比较也值得进一步研究。

综上所述,本研究从精气神口服液中指认了8种活性成分,在此基础上建立了指纹图谱及4种活性成分同时测定的方法。指纹图谱作为一种中药质量控制模式,可以对中药成分进行有效的分析,并且与多成分含量测定相结合进一步达到中药质量评价,为后续质量标准的制定提供参考,也可为后续动物和细胞层面实验提供剂量依据,以期更好地评价其质量研究。