内蒙古牛场牛病毒性腹泻病毒调查分析与研究

刘建慧，张永明，，3*，赵雪城，张凯凯

（ 1. 内蒙古师范大学，内蒙古 呼和浩特 010000 ； 2. 内蒙古大溪生物科技有限公司，内蒙古 呼和浩特 010000 ； 3. 内蒙古为旭生物科技有限公司，内蒙古 呼和浩特 010000 ）

牛病毒性腹泻病（BVD）是一种威胁牛场安全且常见的传染疾病，可感染各年龄段牛的呼吸系统和消化系统，并造成一定程度损伤的一种免疫抑制疾病[1]。BVD 又名牛病毒性腹泻-黏膜病（BVD-MD），病原为黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）[2]。BVDV属于单股正链RNA病毒，基因组全长约12.3～12.5 kb，由一个开放阅读框（ORF）和5'-UTR及3'-UTR组成[3]。BVD在世界各个地方流行，呈全球化分布，春、冬两季发病率较高[4]。BVD最早发生于美国，典型症状是腹泻，其他症状包括高热、萎靡不振、厌食、流鼻涕和唾液增多，也会影响母牛繁殖等。BVDV最常见于牛群中，其中以犊牛最易感[5]，可感染猪[6]、骆驼及其他反刍动物[7]，也会感染鹿、袋鼠等动物。BVDV的主要传染源是病畜和带毒动物，其中最具感染性和特殊性的是终生带毒且散播病毒的牛[8]，即持续感染牛（PI牛）。

我国于1980 年首次发现BVDV 的踪迹，随后于1983年首次分离并且鉴定到毒株[9]，之后在不同省份均有检出，进而表明其呈现一种全国性流行的趋势。本研究针对内蒙古部分地区的牛场感染BVDV 的情况进行了调查和分析，以期为牛场预防和管理提供参考，填补内蒙古各地区BVD 的流行病学数据空白，也对该病的预防与治疗提出综合性建议。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

在2021 年1 月至2022 年8 月，对内蒙古自治区的6 个荷兰斯坦牛牛场采取随机抽样方法收集试验所需的2 400份血清样品（其中鄂尔多斯、巴彦淖尔、呼和浩特、乌兰察布、通辽、包头牛场各400头），血清需在-20 ℃的冷库中存放。试验牛体重在420～490 kg之间，饲料以优质干草和各种蛋白质精料为主。

1.1.2 试剂与仪器

动物植物病毒DNA/RNA 快速提取试剂盒（西安天隆科技有限公司）、BVD-MD 抗体检测试剂盒cELISA（美国KERNEL 公司）、qRT-PCR 试剂盒TransScript ⅡMultiplex Probe One-Step qRT-PCR SuperMix UDG（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。

生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、超净工作台（济南鑫贝西生物技术有限公司）、全自动核酸提取仪（南京诺唯赞医疗科技有限公司）、全自动PCR分析系统（西安天隆科技有限公司）、医用冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）、96 孔酶标仪（450 nm，北京天石天力医疗器械技术开发中心）、37 ℃恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、微量振荡器（太仓市实验设备厂）、单道移液器（北京大龙仪器设备有限公司）、离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、0.2 mL PCR 8-strip Tubes 和Flat 8-strip Caps（沈阳依托生物有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 BVD抗体检测

试验前1 h 将试剂盒从冰箱中取出回复室温；准备好足够的洗涤液工作液备用，一份浓缩液加入9份去离子水，得到工作液。设置好对照及样品在抗原包被板的位置，建议将阴性和阳性对照血清分隔加入，所有孔中加入50 μL的BVDV Assay Diluent检测液，在设定的对照孔分别加入阳性对照和阴性对照各50 μL，其余作为样品孔中加入50 μL 的样品血清。封板膜封好，室温20～25 ℃中避光孵育60 min；弃去板中的液体，每孔加入300 μL 洗涤液洗板5 次，最后将板孔拍干。所有孔先加入50 μL 的Conjugate酶标结合物，之后每孔加入50 μL的Mab单抗，封板，温箱37 ℃下暗处避光孵育30 min；每孔加入300 μL 洗涤液洗板5次，板孔拍干；每孔加入100 μL的TMB底物，室温20～24 ℃下暗处避光孵育15 min 每孔加入100 μL 终止液，酶标仪450 nm读数，计算样品阻断率。

有效性判定：阴性对照的OD 平均值必须大于0.5，阳性对照阻断率≥50%。

样品结果判定：样品PI值小于40%，即为抗体阴性；PI值大于50%，即为抗体阳性；结果在阴性和阳性之间为可疑,可在56 ℃下温育30 min后复核。

1.2.2 BVD抗原检测

试验前待测样品、所有试剂恢复到室温20～25 ℃，用天隆科技动物植物病毒DNA/RNA 快速提取试剂盒提取。试剂盒各组分使用充分融化混匀，离心管内的试剂需离心数秒后使用。

反应体系（20 μL）：2×PerfectStartTMMultiplex Probe One-Step Reaction Mix 10 μL、TransScript Ⅱ Multiplex Probe One-Step Enzyme Mix UDG 0.8 μL、RNase-free Water 5.6 μL、上下游引物各0.4 μL、探针0.8 μL、样本2 μL。引物及探针序列由深圳华大基因科技有限公司合成，见表1。

表1 BVDV引物序列Tab.1 BVDV primers sequence

将配好的试剂放在全自动PCR分析系统机器中，反应程序：50 ℃逆转录5 min；94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，45 个循环。试验结束后记录试验数值。

试验成立条件判定：阳性对照的CT 值为32～34；阴性对照为无CT值。

样品结果判定：样品有CT 值时，抗体判定为阳性；无CT值时，判定为阴性。

2 结果与分析

本试验采用BVDV 的抗原和抗体试剂盒对2021—2022 年在内蒙古自治区6 个荷兰斯坦牛牛场采集的2 400 份血清样品进行检验，抗原检验结果见表2，抗体检验结果见表3。

表2 2021—2022年各牛场血清样品BVDV抗原检验结果Tab.2 BVDV antigen test results of serum samples in cattle farms from 2021 to 2022

表3 2021—2022年各牛场血清样品BVDV抗体检验结果Tab.3 BVDV antibody test results of serum samples in cattle farms from 2021 to 2022

由表2 可知，在2 400 血清样品中，BVDV 抗原阳性数量为460，占总数的19.17%。其中鄂尔多斯牛场的阳性数量最多，占其检测样品的28.50%；包头牛场的阳性数量最少，占其检测样品的10.50%。6个牛场样品BVDV抗原阳性率的范围是10.50%～28.50%。

由表3 可知，在2 400 血清样品中，BVDV 抗体阳性数量为334，占总数的13.92%。其中乌兰察布牛场的阳性数量最多，占其检测样品的19.50%，巴彦淖尔牛场的阳性数量最少，占其检测样品的8.00%。6 个牛场样品BVDV 抗体阳性率的范围是8.00%～19.50%。

3 讨论

近年来，我国牛养殖业快速发展。内蒙古是我国牛养殖基地最多的地区，进行BVDV 检测对维护牛群健康、提高养殖效益、促进牛养殖业发展具有非常重要的意义。1995 年，申之义等[10]调查发现，内蒙古西部地区BVDV 阳性检出率为62.5%，最高阳性检出率为100%。2013 年，童钦[11]对内蒙古自治区的地区进行了BVDV的检验，阳性检出率为58.35%。2014 年，李智勇等[12]对来自内蒙古地区17个牛场的血清进行BVDV抗体检测，发现抗体阳性平均率为88.9%（共2 391份样品）；对5个牛场进行BVDV的抗原检测，抗原阳性平均率为3.6%（共222份样品）。

本试验于2021—2022 年在内蒙古鄂尔多斯、巴彦淖尔、呼和浩特、乌兰察布、通辽和包头等6个不同地区的牛场采集了2 400份的血清样品，结果显示，来自6个牛场的样品BVDV 抗原阳性率为10.50%～28.50%，抗原阳性平均率为19.17%；样品BVDV抗体阳性率为8.00%～19.50%，抗体阳性平均率为13.92%。结果表明，内蒙古不同地区均存在BVDV 感染，但相比前几年的阳性检出率呈下降趋势，也从侧面提示养殖户已开始重视对相关的检测和防控处理。6 个牛场综合评估中，鄂尔多斯牛场的情况比其他牛场严重，针对鄂尔多斯牛场的阳性抗原检出数量和阴性的检出数量进行分析，推测该牛场可能存在PI牛。PI牛存在免疫耐受现象，终生携带BVDV，并且终生向外界排毒[13]。识别PI牛可通过检测抗原和抗体，因为PI牛抗原检出是阳性，抗体检出为阴性，说明PI牛不能产生抗体[14]。因此，识别鉴定PI牛、发现后及时隔离处理是预防和控制BVDV最为有效的措施，也是对养殖场保护的一大重要措施。

其他地区血清样品BVDV 的检测结果表明，牛感染BVDV的原因存在多方面可能。如祁小英[15]研究发现，新生牛犊和幼龄牛易感性较高；BVDV冬季和夏季的发病率较高，发生过BVD 疫情的牛场会出现反复性暴发[16]，两者提示BVDV 存在季节性和地域性；牛引入来源地的不同，原产地的不同也会影响牛的体质；牛群群居环境的差距，牛场的消杀和清理周期不同也是患病的影响因素之一，每天定期清除排泄物的群体的感染风险低于2 d清理一次的群体；此外，接种疫苗情况也是牛感染BVDV 的影响因素之一，应根据当地的实际情况进行科学接种预防感染等。

综上，BVD与牛群所处环境和卫生清洁情况以及养殖户的饲养管理密切相关。因此，为预防BVD 蔓延和暴发须采用综合性的措施。首先，在日常饲养中应定期清理牛棚并进行消杀处理，加强对养殖场的蚊、鼠以及其他害虫的防治以预防中间宿主传播，可以安装灭蝇灯和老鼠夹等。建立健全的消毒管理体系，选择合适的消毒药剂与消毒药品，切断感染和传染途径[17]。其次，犊牛应使用高温消杀后的新鲜乳汁饲喂，也可适当服用抗病毒性药物进行预防[18]。同时注意加强对人员进出的管理，进入牛棚前更换消毒洁净的工作服，严禁无关人员和接触其他动物的人员进入，避免交叉感染[19]。新购入的牛应先进行单独隔离，避免不同来源的动物在同一个圈舍中饲养[20]，以预防疾病的传播和扩散。牛场必须建立健全的卫生检疫体系，定期监测病毒抗体水平。提高饲养管理水平，应根据牛的身体供应健康平衡的营养饲料，严格把控食物的来源，严禁选用劣质和霉变的饲料[21]，也要定期检测水源质量，降低感染率。

目前，治疗BVD一般采用收敛止泻[22]和强心补液两种方法，补液一般选择静脉注射葡萄糖等[23]。近年来，随着中草药在畜禽养殖中的应用愈发广泛，使用中草药也成为治疗BVDV的新选择。刘玲利[24]研究表明，苦参碱和淫羊藿苷对BVDV具有抑制作用。预防BVD仍以接种疫苗为主，根据本地区养殖场BVD流行病学的实际情况，针对性接种牛病毒性弱毒疫苗和猪瘟兔化弱毒疫苗等，从而高效地防范BVDV感染[25]。

4 结论

本研究调查了内蒙古地区6 个牛养殖场内BVDV 的抗体、抗原水平，结果显示，BVD在内蒙古自治区部分地区的牛养殖场存在感染情况。针对这种传染性疾病，养殖户首先需要了解病毒的流行特点和危害，遵循预防大于治疗的原则采取相应的预防措施；若发现疑似症状的病牛应立即隔离诊断治疗，病死牛进行无害化处理，防止病毒蔓延传播。综上所述，应高度重视BVD 的预防、诊断和治疗，建立科学的疾病预防、诊断、治疗管理体系，及时对病牛和周边环境做出相应处理，保障牛群安全。