基于可培养技术的中国不同城市家用冰箱中细菌多样性研究

蔡云虹,刘学孜,刘丽娜,葛媛媛 ,谢九艳,张军,高逸,张健,袁帅,庞玲玲,王喆*,姚粟*

1(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,100015)2(合肥华凌股份有限公司,安徽 合肥,230601) 3(中标能效科技(青岛)有限公司,山东 青岛,266200)

在全球倡导“健康环保”大背景下,跨领域的健康家电技术研发成为推动轻工业高质量发展的趋势。冰箱内环境卫生状况及微生物多样性研究近年来备受关注。而微生物通过未清洗的食材、食材包装表面或消费者手部携带等途径进入冰箱内环境,且部分菌株如假单胞菌(Pseudomonassp.)、气单胞菌(Aeromonassp.)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)可在低温环境下生长[1-2],造成冰箱使用过程中的微生物污染[3],或引起食品腐败而产生异味[4]。此外,不良存储习惯也可能造成食材交叉污染,在食用即食产品时带来潜在安全隐患[5-6]。

目前,国内外关于家用冰箱卫生状况调研、微生物群落多样性的研究,大部分集中于冰箱中食源性致病菌的检测,而针对不同地域及不同位点下的冰箱在使用过程中的细菌多样性鲜有报道。KENNEDY等[7]调研了爱尔兰地区1 020户用户使用习惯与其中900台冰箱的卫生状况,发现使用习惯较好的消费者冰箱中检出的菌落总数相对较低。CATELLANI等[8]研究意大利293台受试冰箱后发现,不同位点卫生状况存在差异性,冷藏室底部相较冷藏室侧壁的菌落总数较高。利用传统培养技术的研究表明,冰箱冷藏室中的细菌主要以不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为主[1]。羊宋贞等[9]在中国5台冰箱中分离得到14株条件致病菌,主要为葡萄球菌属(Staphylococcus),占总分离细菌株数的16.67%。而广泛关注的L.monocytogenes在伊朗180台家用冰箱的检出率为0.5%[10]。

本研究选取中国5个不同城市的冰箱样品,采集不同位点,基于可培养技术开展细菌多样性分析,系统性摸底调研家用冰箱使用过程中的微生物污染状况,探究细菌多样性及优势菌株分布,重点关注食品腐败菌、产异味能力菌株或有潜在致病风险菌株的分布状况,为升级优化保鲜技术,实现针对不同位点的精准控菌,研发健康家电奠定基础。

1 材料与方法

1.1 采样对象和试剂

依据地理位置以及不同地域饮食习惯差异,选取哈尔滨、北京、青岛、成都、广州5个城市,每个城市3台冰箱,共15台样品开展入户采集。针对冰箱主要存放食品类型,兼顾不同用户的家庭结构、冰箱使用频率及清洁频率,根据冰箱结构特征及文献调研,确定冷藏室果蔬篮及内壁、冷藏室门搁架、冷冻室内壁和冷藏室空气等4个采样位点。

2021年11月至2022年5月共采集60个样本,采样前要求用户2周内不做彻底清洁。详细信息见表1。

表1 家用冰箱样品信息表Table 1 Information of the tested domestic refrigerators

TSA(BD)、R2A琼脂(BD)、哥伦比亚血琼脂平板、0.85%生理盐水,北京陆桥技术股份有限公司;丙三醇,国药集团化学试剂有限公司;琼脂糖,北京全式金生物技术有限公司,PCR引物,生工生物工程(上海)股份有限公司;QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit,QIAGEN。

1.2 仪器与设备

AC2-6S1生物安全柜,ESCO公司;DK-8AX隔水式培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;微量可调移液器,德国Eppendorf公司;648L冰箱,海尔智家股份有限公;电子天平,常熟市佳衡天平仪器有限公司;高压灭菌锅,日本HIRAYAMA公司;旋涡震荡仪,德国Votex公司;基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)仪,德国BRUKER公司;EC250-90电泳仪、Gel DoCqM EZ凝胶成像仪,美国BIO-RAD;PCR仪,美国ABI公司;MA-100ST浮游菌采样器,西瓦卡公司。

1.3 实验方法

1.3.1 采样方法

1.3.1.1 电冰箱内接触表面采样

参考GB/T 18204.4—2013《公共场所卫生检验方法 第4部分:公共用品用具微生物》附录A 公共场所、公共用品用具采样方法,分别在冷藏室门搁架、冷藏室果蔬篮及其上下左右内壁、冷冻室抽屉内壁各随机选取6个点,将无菌棉拭子于5 mL无菌生理盐水中浸润,在采样区(5 cm×5 cm)均匀涂抹5次,用灭菌剪刀剪去棉签手接触部位,并将剩余棉拭子置于无菌生理盐水,封口并置于采样箱中,于2～8 ℃下保存并运输,每个采样位置收集2份样品。

1.3.1.2 电冰箱空气样品采样

参考GB/T 18204.3—2013《公共场所卫生检验方法 第3部分:空气微生物》中的方法,在采样前使用75%的酒精分别对采样人员双手、培养皿和仪器表面进行消毒,将贴有玻璃纸的TSA培养基放装入浮游菌采样器内,再置于冰箱冷藏室进行采样,设定采样流量为100 L/min,采样时间10 min。采样完成后,将培养皿用封口膜封口,于2～8 ℃下保存并运输。

1.3.2 分离方法

冰箱表面采集的样品,以10倍梯度逐级稀释,制得1∶10的样品悬液。采集的冷藏室空气样品,将TSA培养基上的玻璃纸,置于无菌培养皿中,用5 mL PBS缓冲液进行反复冲洗回收,制成样品悬液。

吸取100 μL原液和稀释液分别涂布于TSA、R2A、哥伦比亚血平板,每组平行2个,然后分别置于30 ℃和6.5 ℃下好氧培养7～10 d。每天观察不同条件下培养基上的菌落特征,选取培养基上不同形态的单菌落,通过平板划线进行纯化,并记录菌落形态特征和数量。

1.3.3 菌种鉴定

1.3.3.1 MALDI-TOF MS鉴定

采用甲酸萃取法制备检测样本,分别挑取培养皿中各菌株菌体,混匀于300 μL超纯水中,添加 900 μL无水乙醇充分振荡,离心菌体并去除上清液,完全去除乙醇后,用50 μL 70%(体积分数)甲醇重悬菌体细胞,再加入50 μL乙腈,通过移液枪反复吹打混合悬液;将制备的悬液按照MALDI-TOF MS检测规程进行鉴定分析,确定菌株种水平分类学地位。结果得分位于2.00～3.00,表示可鉴定到种水平;结果得分位于1.70～1.99,表示可鉴定到属水平;结果得分位于0.00～1.69,表示没有可信的鉴定结果。

1.3.3.2 16S rDNA基因序列测定

对于未有鉴定结果的菌株,分别提取各菌株的基因组DNA,以基因组DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用正向引物27F和反向引物1492R进行PCR扩增,PCR反应条件参数如下:94 ℃,5 min,1 cycle;94 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、1.5 min,30 cycles;72 ℃,10 min,1 cycle。将得到的PCR产物送至生工生物进行16S rDNA基因序列测定。使用EzBioCloud服务器(www.ezbiocloud.net/identify) 进行相似性搜索,将菌株的16S rRNA基因序列与已发表的有效种进行比较,获得菌株的分类学地位。

1.4 数据分析

使用Kruskal-Wallis test (www.statskingdom.com/kruskal-wallis-calculator.html)对冰箱不同部位及不同地区冰箱的菌落总数及嗜冷菌总数进行统计分析。P<0.05时认为数据间有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 家用冰箱使用过程中的微生物卫生状况

如表2所示,5座城市15台冰箱中,冷藏室果蔬篮及内壁、冷藏室门搁架、冷冻室内壁的微生物总数为102～103CFU/cm2,嗜冷菌总数为101～102CFU/cm2;冷藏室空气微生物总数在10 CFU/m3左右,而冷藏室空气嗜冷菌几乎无法检出。结果显示,电冰箱的微生物总数和嗜冷菌总数的分布趋势一致。使用Kruskal-Wallis test对冰箱不同采样位点及不同城市冰箱的微生物总数及嗜冷菌总数开展统计学分析发现,P值均大于0.05,证明15台冰箱不同采样位点及不同城市间的微生物总数及嗜冷菌总数均无显著差异。此外,研究发现样品2的冷冻室内壁、样品7的冷藏室果蔬篮及内壁2个采样位点相比偏高,而样品8各位点的微生物总数相对较少。结合用户的清洁习惯及清洁频率调研情况发现,样品2及样品7的清洁频率较低,且食品贮存时生熟混放,而样品8使用时分区严格且定期进行彻底清洁,推测差异与个人清洁习惯和电冰箱卫生状况具有较大关联。

表2 不同位点及不同城市间家用冰箱样品的微生物总数及嗜冷菌总数结果Table 2 Total viable count of the tested domestic refrigerators

2.2 基于可培养技术的细菌分离鉴定

2.2.1 冰箱中可培养细菌整体分离结果

北京、广州、哈尔滨、成都、青岛5个城市15台冰箱中共分离获得63个属155种459株细菌。在30 ℃培养条件下,共分离到50个属131种350株细菌,结果如图1-A所示。在属水平上分离频次较高的细菌主要为Bacillus101株、Staphylococcus29株、微杆菌属(Microbacterium)22株、微球菌属(Micrococcus)20株。Bacillus内分离频次较高的为蜡样芽胞杆菌(B.cereus)28株,其可在米饭、牛奶、蔬菜等食物中定植,代谢产生肠毒素、催吐毒素等,导致腹泻、呕等,是一类分布较为广泛的食源性致病菌[11];Staphylococcus内分离频次较高的为松鼠葡萄球菌(S.sciuri),共5株,其广泛在动物源食品中分布,具有脱羧酶活性,可产生生物胺,从而导致食品腐败[11];Microbacterium内分离频次较高的为树状微杆菌(M.arborescens),共7株,主要报道来源于植物根茎[11];Micrococcus内分离频次较高的为藤黄微球菌(M.luteus),共19株,来源于人体皮肤表面及空气环境,可代谢汗腺及皮脂,产生异味[11-12]。在6.5 ℃培养条件下,共获得细菌24个属46种108株细菌,结果如图1-b所示。其中分离频次较高的属分别是Pseudomonas,共41株、嗜冷杆菌属(Psychrobacter),共15株和索丝菌属(Brochothrix),共10株。Pseudomonas为文献中广泛报道的嗜冷微生物,其属内的莓实假单胞菌(P.fragi)、阴城假单胞菌(P.umsongensis)及韩国假单胞菌(P.koreensis)均有报道可以在4 ℃下生长[11,13-14]。Psychrobacter也属于嗜冷微生物,其中,海嗜冷杆菌(P.maritimus)及食物嗜冷杆菌(P.alimentarius)报道来自于海鲜产品,并可在4 ℃下生长[13-14]。这些具有低温生长特性的菌株在冰箱冷藏室设定温度内生长,不仅加速食物变质,还对人们的健康构成隐患,因此,在抗菌、除菌技术的优化升级中需关注此类微生物。

a-30℃培养条件下,分离频次>3;b-6.5℃培养条件下,分离频次>1图1 细菌分离株及其分离频次Fig.1 Bacterial isolates and their isolation frequencies

图2表明,30 ℃与6.5 ℃培养条件下共分离获得15个属的共有细菌,在2种培养条件下分离频次均较高的有Pseudomonas、泛菌属(Pantoea)、Acinetobacter与Psychrobacter,这些菌株可适应较广的温度范围,可以在4～30 ℃下生长[11]。30 ℃培养条件下共分离获得35个属的特有细菌,其中分离频次较高的有Staphylococcus、Micrococcus与考克氏菌属(Kocuria)。6.5 ℃培养条件下共分离获得9个属的特有细菌,其中分离频次较高的有嗜冷链球菌属(Peribacillus)。

图2 30 ℃及6.5 ℃培养条件下分离的共有细菌及特有细菌Fig.2 Common bacteria and endemic bacteria isolated under 30 ℃ and 6.5 ℃

2.2.2 不同城市冰箱中可培养细菌的分离鉴定

为探究地域因素对冰箱使用过程中细菌多样性的影响,在属水平上统计冰箱分离株种类和数量。5个城市中,哈尔滨共分离到细菌23个属95株,主要为Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus;北京共分离到细菌35个属124株,主要为Pseudomonas、Bacillus、Microbacterium;青岛共分离到细菌23个属56株,主要为Bacillus、Psychrobacter、Pseudomonas;成都共分离到细菌18个属58株,主要为Pseudomonas、Bacillus、Micrococcus;广州共分离到细菌24个属126株,主要为Bacillus、Staphylococcus、Pantoea。通过主成分分析(图3-a)可知,北京、广州、成都、哈尔滨可培养细菌群落结构具有较高的相似性,广州地区微生物集群聚集相对分离,表明广州地区受试样本的微生物群落结构相对独特。

a-主成分分析;b-共有细菌情况(属水平)图3 不同城市冰箱中可培养细菌的共有性分析Fig.3 Commonality analysis in household refrigerator samples among different cities

结果显示,Bacillus、Staphylococcus、Acinetobacter、Kocuria、Micrococcus和Psychrobacter在5个城市中均有分布。其中Bacillus在15台冰箱中均有分布。这类菌属常分离于土壤、水、空气与食材中,是常见的环境微生物[11],容易通过环境与和冰箱贮存食物进入冰箱,对冰箱的卫生环境造成潜在威胁。已有研究表明,在生的、洗过的和冷冻的蔬菜中,在新鲜的、冷冻的和贮存的鱼产品中,以及在变质的肉、牛奶和奶酪中,都曾分离出这类菌属。

2.2.3 冰箱不同采样位点可培养细菌的分离鉴定

为探究冰箱不同采样位点对冰箱使用过程中细菌多样性的影响,统计对比4个采样位点分离株种类和数量,冷藏室果蔬篮及内壁共分离得到细菌33个属150株,主要为Bacillus、Pseudomonas、Pantoea;冷藏室门搁架共分离得到细菌36个属126株,主要为Bacillus、Pseudomonas、Psychrobacter;冷冻室内壁共分离得到细菌30个属141株,主要为Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus;冷藏室空气共分离得到细菌16个属42株,主要为Micrococcus、Staphylococcus、Moraxella。通过主成分分析(图4-a)可知,冷藏室空气位点的群落结构更加聚集,表明各冷藏室空气样品间差距较小。而冷藏室果蔬篮及内壁、冷藏室门搁架、冷冻室内壁的群落结构相对分散,且彼此之间没有显著差异。

a-主成分分析;b-共有细菌情况(属水平)图4 不同采样位点样品可培养细菌的共有性分析Fig.4 Commonality analysis in household refrigerator samples among different sample sites

如图4所示,15台冰箱各位点无共有细菌,其中10台冰箱冷藏室果蔬篮及内壁分离得到Bacillus;12台冰箱冷藏室门搁架分离得到Bacillus;7台冰箱冷冻室内壁分离得到Bacillus;9台冰箱冷藏室空气中分离得到Micrococcus。对比不同位点下的分离结果,80%的冰箱的可接触表面中均分离得到Bacillus。据文献报道,部分Bacillus菌株具有独特的具有S蛋白层(S-layers),该蛋白使微生物具有强烈的抗辐射能力[11]。因此,在后续冰箱研发接触表面的抗菌材料时,应重点关注Bacillus在抗菌材料上的生长特性与抗性。同时,60%的冰箱的冷藏室空气中分离得到Micrococcus,其广泛报道来源于人体皮肤表面和空气中,是空气中的优势菌属[15]。属内主要为藤黄微球菌(M.luteus),该菌株可代谢产生挥发性物质,使人体及环境产生异味,同时具有较强的Grammar射线抗性[16],后续针对冰箱如光触酶、离子法等主动杀菌方式的优化中,应重点关注对该菌株的除菌效果。

3 讨论与结论

冰箱作为家庭生活必不可缺的食品贮存电器,其细菌多样性备受关注。本研究从5个城市15个冰箱样品中共分离获得细菌63个属155种459株细菌。30 ℃培养条件下分布较多的为Bacillus、Staphylococcus和Microbacterium,6.5 ℃培养条件下分布较多的为Pseudomonas、Psychrobacter和Brochothrix。其中,Bacillus、Pseudomonas、Staphylococcus和Pantoea在文献中广泛报道[1,8-10]。而Psychrobacter、Brochothrix、Erwinia、明串珠菌属(Leuconostoc)、气球菌属(Aerococcus)为本研究新发现的分离频次较高的菌株,可能由于参研冰箱所处地理环境位置不同,存放的食材及样品部件采集位置不同等原因造成的差异性。

本研究也重点关注具有潜在致腐性、产异味性及条件致病性的细菌,其中分布较广、且分离频次较高的关键细菌有Pseudomonas、Bacillus、Staphylococcus、Brochothrix、Moraxella和Micrococcus,具体分离城市与位点如表3所示。其中,具有潜在低温致腐性的关键细菌应重点关注莓实假单胞菌(P.fragi)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)及热杀索丝菌(B.thermosphacta)。据文献报道,P.fragi具有脂酶和蛋白酶的活性,4 ℃条件下在肉、鱼等食材表面形成带有黏液的生物膜,在食物变质过程中可产生乙基己酸酯、乙基辛酸酯、乙基壬酸酯等挥发性有机物,在低温条件下具有潜在的致腐特性和产异味特性[17-18];P.fluorescens可在食品中产生蛋白酶、脂酶导致食品腐败,是水产品、蔬菜、肉制品、乳制品的优势腐败菌[18];S.sciuri广泛在动物源食品中分布,具有脱羧酶活性,可产生生物胺,从而导致食品腐败[11];B.thermosphacta可在低温有氧条件下生长并使食物产生绿色腐败液、代谢恶臭终产物(乙偶姻等)致使食物变质,在低温条件下具有潜在的致腐特性和产异味特性[11]。具有产异味性的关键细菌应重点关注奥斯陆莫拉氏菌(M.osloensis)与M.luteus。据报道,M.osloensis是人类生活环境中常见的产异味细菌,部分菌株可能代谢恶臭终产物4-甲基-3-己烯酸,具有潜在的产异味特性[19];M.luteus广泛来源于哺乳动物皮肤和环境中,可以通过赖氨酸脱羧酶代谢尸胺,具有潜在产异味特性[12]。参考《人间传染病目录》报道条件致病菌,本研究重点关注的三级条件致病菌有蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、成团泛菌(P.agglomerans)、浅绿气球菌(A.viridans)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)。其中,B.cereus的部分菌株能够引起腹痛和腹泻、急性恶心和呕吐2种典型症状[20],可来源于肉类、菜类、酱料(香草),也是冰箱中广泛报道的菌株;P.agglomerans的部分菌株可引起人体产生菌血症[20];A.viridans的部分菌株可引起心内膜炎、尿路感染等症状产生[11];S.saprophyticus的部分菌株可引起女性泌尿系统感染[11]。而文献中广泛关注的条件致病菌L.monocytogenes、小肠结肠炎耶氏菌(Y.enterocolitica)、大肠杆菌(E.coliO157)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和沙门氏菌(Salmonella)并未在本研究中分离得到。

表3 冰箱使用过程中关键细菌的特性及分离情况Table 3 Characteristics and isolation of key bacteria in tested domestic refrigerators

综上,本研究基于可培养技术,探究不同地域和电冰箱不同采样位置的微生物的细菌多样性。从5个城市15个冰箱样品中共分离获得63个属155种459株细菌。其中,5个城市共有细菌为芽胞杆菌属(Bacillus),7台冰箱可接触表面的共有细菌为芽胞杆菌属(Bacillus),9台冰箱中空气的共有细菌为微球菌属(Micrococcus)。重点关注普遍存在且具有潜在条件致病性、致腐特性和产异味特性菌株,确定芽胞杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、索丝菌属(Brochothrix)、莫拉氏菌属(Moraxella)和微球菌属(Micrococcus)为中国家用冰箱中的关键细菌,在后续针对冰箱抗菌除菌技术的优化升级中,应重点关注针对这些关键细菌的科学控制,以期推动实现家庭环境微生态健康。