隔山消高效液相指纹图谱研究及分析

朱丹,黄雨睿,罗文静,麻秀萍

(贵州中医药大学 药学院,贵州 贵阳 550025)

隔山消,又名飞来鹤(《植物名实图考》)、耳叶牛皮消 (《中国药用植物志》) 、隔山撬 (《分类草药性》、白首乌 (江苏、江西) ,牛皮冻 (湖南,四川) ,过山消 (广西) ,羊角藤根 (贵州) 等[1];是萝藦科植物耳叶牛皮消的干燥块根[2]主要分布在我国的云南、贵州、四川等地的少数民族聚居区[3],为苗族、布依族、土家族的民族药。隔山消化学成分复杂,主要有苯乙酮类[4-6]、C21-甾体苷类[7-8]、有机酸类,黄酮类、糖类[9-10]、生物碱类以及醛类等化学成分。具有改善胃肠道[11]、抗肿瘤[12-14]、抗氧化[5-6]等多种药理作用。

目前,贵州省内有以隔山消药材为主药制成的中药制剂用于临床,且有显著的疗效,如贵州永乐药业有限公司生产的“消痞和胃胶囊”,贵州飞云岭药业股份有限公司生产的“隔山消积颗粒”。中药材的质量直接决定其疗效,且不同地区的隔山消的化学成分含量差异较大,所以,有必要对隔山消药材的质量控制进行研究,提高其质量标准,使中药材和中药制剂质量更加稳定,发挥更加稳定的临床疗效。

中药指纹图谱是指通过一定的分析手段,如HPLC、GC、LC-MC,得到的共有峰的谱图,可用于评价中药的真实性、稳定性和一致性,对提高中药的质量,促进中药现代化[15]。

基于此,本文拟用20批不同产地隔山消药材作为研究对象,建立HPLC指纹图谱,进一步地提高中药材和中药制剂质量的稳定性和可控性,保证中药制剂的临床疗效,为更好地促进中药材和中药制剂的可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Shimadzu Essentia LC-16(紫外-可见检测器、二元梯度泵、岛津液相色谱系统化学工作站、日本Shimadzu公司);Kinetex C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;KQ-300DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);CN-LPC6002型电子天平(昆山利平计量设备有限公司);Microliter Syringes微量进样器(25 μL,上海高鸽工贸有限公司);SHZ-D(III)型循环水真空泵(邦西仪器科技上海有限公司);抽滤装置(2 000 mL天津市津腾实验设备有限公司)。

乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司);甲醇为分析纯(重庆川东化工有限公司);磷酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司);实验用水为重蒸馏水。隔山消样品从各地中药材市场购得,经粉碎后过50目(筛孔径0.3 mm)筛备用,具体样品信息见表1。

表1 20批隔山消样品信息

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备

将隔山消药材粉碎后过50目筛(筛孔径0.3 mm),取过筛后药材粉末1.5 g,精密称定,置于50 mL具塞锥形瓶中,精密加入70% 甲醇10 mL,密塞并称重,超声30 min,70% 甲醇补重,摇匀,过滤,续滤液用0.22 μm微孔滤膜滤过即得。

1.2.2 色谱条件

色谱柱:Kinetex C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:流速1.0 mL·min-1;进样体积:20 μL;检测波长:210 nm;柱温:常温;0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱,具体洗脱程序见表2。

表2 0.1%磷酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 隔山消指纹图谱的建立

将20批隔山消指纹图谱导入中药指纹图谱相似度评价软件(2012.130732版本)进行相似度评价计算,以S12为参照,对照图谱生成方法为中位数,时间窗高度为0.1,经过多点校正,生产对照指纹图谱和叠加指纹图谱。与对照图谱比较,各指纹图谱的相似度在0.883～0.991之间,其中贵州毕节7月相似度为0.883,与对照图谱比较相似度最低,可能由于产地、月份、气候、制备工艺不同,而其他批次相似度均在0.9以上,一般情况下相似度在0.9～1.0符合要求,所以说明其他各批次间共有成分基本一致。相似度评价结果见图1。

图1 隔山消HPLC对照指纹图谱

2.2 方法学验证

2.2.1 精密度试验

按“1.2.1”项的方法制备供试品溶液,按照“1.2.2”项下色谱条件连续进样6次,记录色谱图。以S3为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值小于3%,表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验

按“1.2.1”项的方法制备6份供试品溶液,按照“1.2.2”项下色谱条件重复进样6次,记录色谱图。以S3为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值小于3%,表明该方法重复性良好。

2.2.3 稳定性试验

按“1.2.1”项的方法制备供试品溶液,室温放置0,2,4,8,12,24 h时,按照“1.2.2”项下色谱条件进样测定,记录色谱图。以S3为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值小于3%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3 相似度评价

将20批隔山消指纹图谱导入中药指纹图谱相似度评价软件(2012.130732版本)进行相似度评价计算,以S12为参照,对照图谱生成方法为中位数,时间窗高度设定为0.1,经过多点校正,生产对照指纹图谱和叠加指纹图谱。与对照图谱比较,各指纹图谱的相似度在0.883～0.991之间,其中贵州毕节7月相似度为0.883,与对照图谱比较相似度最低,可能由于产地、月份、气候、制备工艺不同,而其他批次相似度均在0.9以上,一般情况下相似度在0.9～1.0符合要求,所以说明其他各批次间共有成分基本一致。相似度评价结果见表3。

表3 20批隔山消相似度评价结果

2.4 聚类分析(CA)

聚类分析是指将物理或抽象对象的集合分组为由类似的对象组成的多个类的分析过程,目标是在相似的基础上收集数据来分类。

本论文采用 SPSS 26.0软件,以20批隔山消中的23个共有峰的峰面积为变量,采用组内连接方法,平方欧式距离进行聚类分析,结果见图2。结果显示当平方欧式距离为 25 或20时,20批隔山消药材可分为 2 类,S6、S10、S13、S14、S19 为一类,其余批次的隔山消药材为另一类;当平方欧式距离为15时,20批隔山消药材可分为3类,S6、S10、S13、S14、S19 为一类,S12单独为一类,其余批次的隔山消药材为另一类。这可能与药材来源、产地、制备工艺、采摘季节等因素有关,导致批次之间隔山消药材的质量有差异。

图2 20批隔山消指纹图谱共有峰聚类树状图

2.5 主成分分析(PCA)

主成分分析是对复杂的多个变量进行降维,通过少数几个代表性的成分反映原始数据的大部分信息[12],是原始变量的线性组合。

为综合评价不同批次间隔山消药材的质量差异,将20批样品23个共有峰的峰面积作为原始数据,采用SPSS 26.0软件进行主成分分析。以特征值>1为标准,共得到7个主成分,其特征值分别为10.064,2.727,2.336,1.932,1.418,1.198,1.011,对总方差的累积贡献率为89.939%(>80%)。其中主成分1反映1,5,7,9,10,15,17,18,20～23号峰的信息;主成分2反映8,11,12,14,19号峰的信息;主成分3反映3,4,6号峰的信息;主成分4反映6,13号峰的信息;主成分5反映2号峰的信息;主成分6反映12号峰的信息;主成分7反映16号峰的信息。采用正交性旋转法,得到23个共有峰在7个主成分的主成分载荷矩阵,见表4,根据主成分载荷矩阵,可算出主成分得分系数矩阵,见表5。

表4 主成分载荷矩阵

表5 主成分得分系数矩阵

根据主成分得分系数矩阵,可见23个变量对各主成分的正负相关。对比各共有峰,3号峰对不同批次的隔山消指纹图差异的贡献值较小,分离度好(大于1.5),且峰面积适中,作为指纹图谱的参照峰合适,说明本实验隔山消指纹图谱所选取的参照峰合理。

根据表5,以Z1、Z2、Z3、Z4、Z6、Z7分别表示主成分1,2,3,4,5,6,7,Z代表7个主成分的综合值,X1～X23分别代表23个共有峰峰面积的标准化数值,用于反映20批隔山消药材所表征的信息,得到线性组合的表达式,所得表达式相加即得综合评价函数,得到20批隔山消药材的综合得分,将其进行排序,结果如表6。

表6 样本主成分得分及排名

Z值越大,表明隔山消药材的综合品质越高。结果显示S19(贵州毕节),S12(四川广安)和S13(贵州毕节)的综合得分最高,质量相对较好,其次是S7(四川广安),S8(四川广元)。这可能与药材来源、产地、制备工艺、采摘季节等因素有关,导致批次之间隔山消药材的质量有差异。

主成分1,2,3的得分值(Z1 ～ Z3)建立其三维坐标体系的散点图,见图3。由此可知,S12较分散可单独聚为一类,S6、S10、S13、S14、S19可聚为一类,其余批次的隔山消药材聚为一类,结果与聚类分析一致。

图3 20批隔山消主成分分析的三维散点图

3 结论与讨论

综上所述,本实验通过对20批隔山消药材建立HPLC指纹图谱,样品的出峰数目、分离度较理想,符合指纹图谱研究的技术要求。并结合中药指纹图谱结合化学模式识别手段应用最普遍的分析方法,即相似度分析、聚类分析、主成分分析对隔山消药材进行评价[12],除贵州毕节的隔山消药材相似度在0.9以下,其余批次均在0.9以上,聚类分析可分为三类,提取了7个主成分,得出贵州毕节(2022年4月)和四川广安(2021年7月)的质量较好。本实验对隔山消药材的质量控制进行了补充,为隔山消的质量标准提高了数据支撑,可供隔山消中药材和中药制剂质量更加稳定,发挥更加稳定的临床疗效。