营养调控对宁乡猪肉品质的影响及其分子机制研究

韩 丽 黄兴国 尹 杰

(湖南农业大学动物科学技术学院,长沙 410128)

猪肉品质作为一个重要的经济性状,其优劣与肌内脂肪(IMF)含量和肌纤维性状密切相关[1]。宁乡猪是我国优良地方猪品种,具有IMF含量高、肉质好、抗病力强等多种优点,已于2020年被列入《国家畜禽遗传资源品种名录》。但背膘厚、腹脂过度沉积、瘦肉率低等问题一直影响宁乡猪的经济效益。因此,重点研究以宁乡猪为代表的优良地方猪,有助于保护我国地方猪品种资源以及开发高品质猪肉。近年来,随着生物技术的发展和研究的逐步深入,针对宁乡猪的研究已从营养手段改善其相关肉品质指标,逐步深入到从分子层面研究营养、基因、转录因子及相关信号通路调控宁乡猪脂肪沉积和肌纤维性状的复杂网络机制。迄今为止,已有大量的脂肪沉积和肌纤维形成相关基因及相关信号通路被报道参与肉品质调控[2],且关于营养靶向RNA表观遗传修饰来调控猪肉品质的研究已成为热点。由此可见,关于如何通过营养干预手段调控宁乡猪脂肪沉积和肌纤维形成相关基因及相关信号通路,并揭示其分子机制,是改善宁乡猪肉品质的关键和问题所在。因此,本文将结合近些年最新研究成果,对宁乡猪肉品质特性、营养干预对肉品质的影响及调控肉品质的分子机制研究进行综述,旨在为系统揭示营养干预调控宁乡猪肉品质的分子机制提供参考和新思路。

1 宁乡猪肉品质特性

1.1 IMF含量

表1 不同品种猪IMF含量和大理石纹评分比较

1.2 脂肪代谢相关基因

皮下脂肪、肝脏或肌肉等组织中脂肪酸组成和富集量有所不同,受遗传基因的调控。宁乡猪背脂、腹脂和肾周脂中脂肪酸分布差异较大,且从背脂、腹脂到肾周脂其饱和脂肪酸总量呈上升趋势,单不饱和脂肪酸总量呈下降趋势[13]。脂肪代谢关键基因参与猪脂肪发育的动态调控过程。Ma等[14]研究发现,宁乡猪与引进品种猪之间存在多种基因组结构性变异(SVs),且2品种猪间共有195个基因表达水平存在显著差异,而宁乡猪特有的SVs可促进其皮下脂肪沉积,这也解释了宁乡猪与引进品种猪在脂肪沉积方面的表型差异。Li等[15]研究发现,不同日龄宁乡猪皮下脂肪组织中差异丰度蛋白有50%以上集中在90～210日龄,可间接调控脂肪细胞的发育和功能。由此推测,宁乡猪遗传特性可能是促使育肥后期宁乡猪背膘厚、脂肪率和腹脂率显著或极显著高于引进品种猪的主要原因[6]。有报道称,宁乡猪育肥期日增重与其背膘厚、脂肪率和眼肌面积呈正相关。由于基因调控的滞后性,发现沙子岭猪皮下脂肪沉积的关键窗口期为90～150日龄,而皮下脂肪细胞发育基因调控的关键窗口期为60～90日龄[16]。因此,可推测宁乡猪脂肪沉积的动态调控规律,其育肥期可能是脂肪沉积的关键时期,而脂质代谢相关基因的转录调控在此时期之前。由此可见,宁乡猪皮下脂肪沉积受脂质相关基因的调控。而营养调控手段可调节宁乡猪脂肪沉积相关基因的表达,有效降低其皮下脂肪沉积[4]。另外,脂肪型地方猪和瘦肉型种猪肠道微生物的多样性和丰度明显不同,2品种猪表型差异显著[17]。粪菌移植技术可使受体表现出与供体相似的表型。因此,研究移植瘦肉型种猪粪菌给宁乡猪,探讨其是否降低了宁乡猪皮下脂肪沉积并揭示其脂质代谢调控机制有重要研究意义。

综上所述,宁乡猪IMF含量更高,且脂肪酸组成和富集量更加丰富,推测原因可能与肠道微生物、脂质代谢和肌纤维形成相关基因以及遗传因素等对肉品质动态调控的分子机制不同有关。因此,有必要通过营养干预手段,特异性调控宁乡猪脂肪沉积和肌纤维性状的关键窗口期,以降低皮下脂肪沉积,促进肌纤维类型转化,进而精准改善宁乡猪肉品质,并揭示其调控机制,为宁乡猪开发利于提供技术支撑。

2 营养调控对宁乡猪肉品质的影响

2.1 能量水平对宁乡猪肉品质的影响

2.2 蛋白质水平对宁乡猪肉品质的影响

2.3 非常规饲料原料对宁乡猪肉品质的影响

2.4 功能性添加剂对宁乡猪肉品质的影响

2.4.1 植物提取物

2.4.2 微生态制剂

猪的胃肠道微生物群与宿主脂质代谢及其肠道健康密切相关。研究表明,通过干预肠道微生物组成可促进微生物代谢产物产生,进而有效改善宿主脂肪酸代谢和脂肪沉积[17]。研究表明,德氏乳杆菌制剂显著降低了宁乡猪血清和肝脏中甘油三酯、总胆固醇、LDL-C含量[27],改善了机体脂质和脂蛋白水平;显著降低了失水率,改善了宁乡猪生产性能、胴体性状和肉品质[28]。由此可见,益生菌可能通过调控调节宁乡猪脂质代谢,从而改善其生长性能和肉品质。其机制可能是营养干预手段调节了肠道微生物及其代谢产物,激活了脂质代谢相关基因,改善了宁乡猪胴体性状和肉品质。

2.4.3 其他功能性添加剂

有报道称,其他功能性添加剂在改善宁乡猪肉品质方面也发挥重要作用。其中,N-氨基甲酰谷氨酸可降低宁乡猪背最长肌剪切力,优化其皮下脂肪组织脂肪酸组成[29]。而亚麻油可提高宁乡猪肝脏中必需氨基酸含量,改善肌肉嫩度[5],提高其肾周脂、腹脂、背脂、背最长肌中α-亚麻酸含量,降低肾周脂、腹脂、背脂中平均n-6/n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)比值[25]。β-丙氨酸有提高宁乡猪pH45 min、降低滴水损失和剪切力的趋势,可提高背最长肌中氨基酸含量,并优化氨基酸组成,改善宁乡猪胴体性状和肉品质[30]。半胱胺可提高宁乡猪屠宰率,降低背最长肌滴水损失和硬脂酸含量,并提高背最长肌亚油酸、二十碳三烯酸、PUFA含量,改善宁乡猪肉品质[31]。甜菜碱可提高了宁乡猪瘦肉率,降低背膘厚、脂肪率、失水率、滴水损失、剪切力、蒸煮损失以及股二头肌和肝脏中粗脂肪含量,改善宁乡猪的胴体性状和肉品质[32]。烟酸可提高宁乡猪瘦肉率,降低脂肪率,并发现厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门操作分类单元(OTUs)变化与宁乡猪脂肪率和瘦肉率变化显著相关,且约有43.75%差异微生物代谢产物与肝脏中的脂类及类脂分子有关[33]。

3 调控宁乡猪肉品质的分子机制

3.1 影响宁乡猪脂质沉积的分子机制

近年来,宁乡猪脂肪沉积相关的基因也逐渐被分离和鉴定,在调节不同部位脂肪代谢和促进IMF沉积方面起着重要的作用。脂肪沉积是一个非常复杂的生物学过程,不仅受饲粮能量、蛋白质等营养因素对脂质代谢相关基因的影响,还受信使RNA(mRNA)、环状RNA(circRNA)、长非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)等对脂肪代谢相关基因及其相关信号网络的调控,共同发挥对宁乡猪肉品质调节作用。

3.1.1 影响宁乡猪IMF和皮下脂肪沉积的机制研究

目前,影响宁乡猪脂肪沉积相关的基因也逐渐被分离和鉴定。脂肪酸结合蛋白(FABPs)可促进脂肪细胞对脂肪酸的摄取以及甘油三酯的合成[34]。李艺阳等[35]研究发现,宁乡猪IMF含量与心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因HinfⅠ和HaeⅢ酶切位点多态性显著相关,其形成的单倍型组合HD/hd的IMF含量最高,这说明该基因表达量与IMF含量相关性较强。骞鑫[36]研究发现,脂肪酸结合蛋白家族4(FABP4)、CD36、脂蛋白酯酶(LPL)、脂蛋白1(PLIN1)、脂联素(AdipoQ)等多个基因是30和90日龄宁乡猪背脂中DEGs,参与宁乡猪背部脂肪沉积的调控;同时,FABP4基因也是30和210日龄宁乡猪背脂的差异上调基因,由此推测该基因表达量与宁乡猪育肥后期背脂沉积能力呈强相关。这说明宁乡猪脂质沉积受多基因共同调控,不同日龄其脂质沉积调控基因存在差异,其机制主要涉及PPAR通路等,具体调控机制还有待进一步揭示[36]。由此可见,不同组织脂质沉积能力不同,H-FABP、FABP4分别在宁乡猪背最长肌、背脂中高表达,其原因可能与脂肪生长发育关键调控基因的表达存在差异有关。Wang等[12]研究发现,CD36、激素敏感脂酶(HSL)、SCD、PPARδ和ANGPTL4等是宁乡猪和大白猪的背最长肌脂质代谢差异表达的候选功能基因,可促进或抑制脂肪酸吸收和脂质积聚,共同参与背最长肌脂质代谢调控。由此可见,不同表型之间背最长肌IMF脂质代谢调控存在差异,主要受上述DEGs影响,在宁乡猪IMF沉积过程中发挥重要调节作用。

已有研究表明,通过营养调控手段可控制上述脂质代谢候选基因,促进或抑制宁乡猪脂肪沉积,进而改善猪肉品质。德氏乳杆菌显著上调了宁乡猪背最长肌中磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)的mRNA表达量,显著上调了其皮下脂肪组织中CD36、LPL、肉毒碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)、ANGPTL4的mRNA表达量[27],促进了脂肪分解,降低了其脂肪率和背膘厚。高能饲粮[18]、甜菜碱[32]、低蛋白质水平饲粮[4]显著上调了宁乡猪背最长肌FABP4、脂肪酸合成酶(FAS)、PPARγ和丙二酰基转移酶(ACC)的mRNA表达量,以及背脂中甘油三酯脂肪酶(ATGL)、组蛋白去乙酰化酶和PPARγ的mRNA表达量;并极显著下调了FAS和FABP3的mRNA表达量,引起IMF含量显著升高,进而调控宁乡猪肉品质。而AMPK处于脂肪调控通路的中心位置,可调控HSL、FABP、PPARγ、ACC等脂质代谢相关基因的表达。推测可能是营养干预手段激活或抑制了AMPK等信号通路,从而调控了脂质代谢相关基因的表达,改善了肉品质。由此可见,许多参与脂肪细胞增殖、分化及脂质代谢调控的基因在调节宁乡猪脂质沉积方面发挥重要作用。

越来越多研究证实,miRNA参与畜禽脂肪生成的调节,其主要作用是抑制mRNA的翻译过程或降解靶mRNA,调控靶基因的表达。陈文武[37]研究发现,30和210日龄宁乡猪脂肪组织中差异miRNA均能预测到与脂肪代谢相关的靶基因,说明miRNA可能参与了宁乡猪脂质代谢调控。已有研究表明,通过营养调控手段可控制基因的甲基化或miRNA来影响脂肪沉积而改善猪肉品质。有报道称,内源性n-3 PUFA含量增加可影响外泌体中miRNA的表达,从而调控脂肪酸去饱和酶(FADS)等关键脂质代谢基因的表达,并催化饱和脂肪酸(SFA)转化为单元不饱和脂肪(MUFA)[38]。邢月腾[25]研究发现,亚麻油可使宁乡猪肾周脂、腹脂和背脂组织中n-3 PUFA含量显著增加,n-6/n-3 PUFA比值显著降低,且显著下调了背脂中ACCα、PPARγ和酰基辅酶A6-去饱和酶2的mRNA表达量。推测可能是增加了宁乡猪脂肪组织n-3 PUFA含量,进而促进了miRNA的表达,调控了背脂中脂质代谢相关基因,从而优化了脂肪酸组成和含量,改善了肉品质。由此可见,营养干预可能影响了脂肪组织中miRNA基因的表达,而脂质代谢相关的miRNA与脂质代谢基因又存在靶向调控关系。因此,可推测营养素-miRNA-脂质代谢基因之间存在相互作用。circRNA在猪脂肪沉积过程中同样具有重要的调控作用[39],其主要功能是对miRNA具有海绵吸附作用以解除miRNA对mRNA的限制,进而调控脂肪沉积基因的表达[40-41];还可吸附RNA结合蛋白等,使其在细胞核内结合相应的miRNA使其甲基化,消除其对相关基因的抑制作用[42],进而实现对脂肪沉积的调控。陈文武[37]研究表明,circ_7903和circ_22931是宁乡猪背脂生长发育有关的circRNA,其脂肪沉积随其表达量的上调而增长;还发现circ_7903与ssc-miR-31和ssc-miR-9843-3p具有互作关系,而ssc-miR-31和ssc-miR-9843-3p又都预测到了与脂肪合成相关的靶基因。因此,可推测宁乡猪背脂沉积受circRNA-miRNA-靶基因等的复杂网络调控,当miRNA对宁乡猪脂肪组织进行调控的同时,circRNA可能也会发挥其海绵吸附作用,进而对宁乡猪脂肪的发育与沉积起着间接调控作用,从而影响宁乡猪脂肪代谢和沉积,具体机制有待进一步验证。

目前,有较多类型的lncRNA被发现与猪只脂肪沉积潜在的调控机制密切相关[43],可介导脂质代谢相关基因和信号通路及相关的miRNA等的调控[44-45]。Gong等[46]研究发现,差异lncRNA在宁乡猪育肥后期皮下脂肪组织的表达明显上调,说明在此阶段其调节活性更高;而预测的差异lncRNA对应的6个靶基因主要参与AMPK等信号通路,调控脂肪组织脂质代谢。这也可能是宁乡猪皮下脂肪过量沉积的原因。Gong等[46]还发现lncRNA可能是mRNA的关键调控元件;大多数差异mRNA在仔猪阶段上调,而在育肥后期下调,而鉴定出的差异mRNA中有6个参与了宁乡猪脂质代谢,3个参与了细胞分化和增殖。这说明宁乡猪脂肪组织中的lncRNA和mRNA共同参与脂肪组织发育或脂质代谢。

综上所述,通过营养干预手段可改善宁乡猪肉品质,其机制可能是影响了宁乡猪脂肪组织中miRNA、lncRNA、circRNA的表达,间接调控了其脂质代谢相关靶基因,进而减少宁乡猪背脂沉积。但是,目前关于宁乡猪不同日龄、不同脂肪组织脂质代谢相关基因,以及营养调控对宁乡猪脂肪组织中非编码RNA表达进而调节脂质代谢相关基因等方面还缺乏系统性研究,且关于营养素-lncRNA/circRNA-miRNA-靶基因等复杂调节网络对宁乡猪肉品质的调控机制还有待进一步深入探讨、验证和揭示,以实现精准降低背膘厚和腹脂率、提升宁乡猪肉品质和养殖效益的目的。因此,针对宁乡猪脂肪沉积的研究,可尝试将营养干预控制lncRNA/circRNA-miRNA-靶基因作为改善肉品质的调控机制的新靶点。

3.1.2 影响宁乡猪肝脏组织脂肪沉积的机制研究

脂肪酸氧化是肝脏脂质代谢的主要通路之一。长链酰基辅酶A脱氢酶(ACADL)、PPARα和短链烯酰辅酶A水合酶1(ECHS1)可促进脂肪酸氧化,减少脂质沉积,调节脂质代谢。邓家桧[47]研究表明,PPARα、ACADL和ECHS1参与宁乡猪肝脏脂肪酸代谢调节,均属于下调基因,其mRNA表达量随体重增加而下调,且3种基因在猪不同生长阶段肝脏中mRNA表达量均存在差异,其中PPARα对宁乡猪脂肪沉积的调控作用较大,与胴体品质和肉质性状的均存在关联。有报道称,通过营养干预可调控肝脏脂质代谢相关基因的表达,进而减少肝脏中脂肪蓄积。秦龙山等[31]研究表明,半胱胺显著上调了肥育期宁乡猪肝脏PPARα的mRNA表达量,从而调控肝脏脂肪酸组成,影响机体脂质代谢。杜仲提取物显著下调了宁乡猪肝脏中FAS、ACC和ATGL的mRNA表达量,显著提高了血清HDL含量,进而影响肝脏脂肪酸代谢[26]。德氏乳杆菌显著上调了宁乡猪肝脏中LPL、CPT-1、ANGPTL4、甘油三酯水解酶(TGH)等的mRNA表达量,显著下调了G蛋白偶联受体41和43的mRNA表达量,调节肝脏脂肪形成[27]。Chen等[18]研究发现,高能饲粮可显著上调肝脏中ACC、FAS和固醇调节元件结合蛋白-1C(SREBP-1C)的mRNA表达量,而低能饲粮显著上调了肝脏中LPL的mRNA表达量。由此可见,通过营养调控可影响宁乡猪肝脏脂质代谢相关基因表达,进而增强肝脏脂质代谢能力,减少肝脏脂肪沉积。

研究发现,lncRNA在调控宁乡猪肝脏脂质代谢中也发挥重要作用,其对miRNA也具有海绵吸附作用。Li等[48]研究发现,宁乡猪肝脏组织中脂质代谢相关的miRNA表达量随着其日龄的变化呈现明显的时间动态特征,尤其ssc-miR-143-3p、ssc-miR-21-5p、ssc-miR-148a-3p等,许多已知的miRNA和新发现的miRNA在肝脏不同时间点表达量较高,在肝脏发育中起至关重要的调节作用。有报道称,miRNA-143-3p可靶向ANGPTL3调节肝细胞中HDL-C含量[49]。miRNA可能参与宁乡猪肝脏脂质代谢。Chen等[50]研究发现,circRNA在不同日龄宁乡猪肝脏中呈现不同程度的高表达,尤其90日龄时circRNA的表达量最高;还发现circRNA在肝脏发育过程中参与多种脂肪代谢调控途径,其中肝脏组织中的Chr45729590_45744165可通过发挥对ssc-miRNA-378和ssc-miRNA-378p海绵吸附作用来调控脂肪组织发育和沉积的相关基因。lncRNA可调控转录后mRNA翻译和降解等过程。Gong等[51]通过鉴定宁乡猪肝脏中mRNA和lncRNA发现,鉴定出的差异mRNA有5个与肝脏脂肪酸代谢相关,其中30日龄宁乡猪肝脏中差异mRNA表达量明显上调,说明其在此阶段肝脏发育中发挥关键调控作用;在210日龄宁乡猪肝脏中大部分差异lncRNA表达量明显下调,说明lncRNA在此阶段调节活性较差,可能是此阶段以增重为主。总之,宁乡猪肝脏中circRNA、lncRNA、miRNA和mRNA在脂质代谢中发挥关键调节作用,但针对营养调控是否通过调节非编码RNA来影响宁乡猪肝脏脂质代谢相关基因还有待进一步验证。宁乡猪脂质沉积关键调控因子及功能见表2。

表2 宁乡猪脂质沉积关键调控因子及功能

3.2 影响宁乡猪肌纤维发育的分子机制研究

猪肌纤维性状的评价指标主要包括肌纤维面积、密度、数量及其类型,直接影响剪切力、系水力、肉色等肉质性状,受肌纤维性状相关基因调控[52]。仔猪出生后饲粮高缬氨酸与异亮氨酸含量对背膘厚度、水分分布形式和肌原纤维蛋白溶解度有显著的相互作用,可影响肌纤维的发育及肌纤维类型的转化[53]。陈佳艺[4]研究发现,低能饲粮可下调宁乡猪背最长肌中MyHCⅡb的mRNA表达量,减缓糖酵解肌纤维的分化和生长,饲粮蛋白质水平与肌肉蛋白合成及其氨基酸组成和含量密切相关,发现低蛋白质水平饲粮显著上调了背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白基因的mRNA表达量,显著提高了背最长肌中必需氨基酸和总氨基酸含量,结果提示,低能、低蛋白质水平饲粮更有利于宁乡猪肉品质改善。天然植物提取物中常含有多种多酚类物质,可增强肌肉生成,促进肌纤维类型的转化。其中,绿原酸可显著下调宁乡猪背最长肌中性氨基酸转运蛋白2的mRNA表达量,改善宁乡猪氨基酸代谢[25]。肠道微生物不仅可直接影响宿主肠道健康,还可通过其代谢产物靶向肌肉组织,影响宿主骨骼肌生长[54]。有报道称,脂肪型或瘦肉型猪的微生物移植给无菌小鼠后,无菌小鼠重现了供体骨骼肌纤维类型[9]。由此可见,通过营养干预技术,若以肠道菌群或差异代谢产物为靶点,调控宁乡猪骨骼肌功能和氨基酸代谢,这将是有效改善宁乡猪肌纤维类型和肉品质的新手段。

肌纤维类型会受到多种因素的影响而发生相互转化。已有研究表明,miRNA在肌纤维发育及其类型转化中发挥关键作用[55]。如miR-27a参与了亮氨酸诱导的猪肌纤维类型转化,显著提高了MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx的mRNA及慢肌蛋白质水平,显著降低MyHCⅡbmRNA及快肌蛋白表达量[56]。miR-324-5p可分别通过靶向Pm20d1和lncdum抑制成肌细胞(C2C12细胞)成肌细胞分化[57]。卢慧[58]通过高通量测序发现,miR-708-5p在宁乡猪各组织广泛表达,并且在骨骼肌中表达量较高,说明miR-708-5p可能与骨骼肌的生长发育相关;还发现miR-708-5p过表达促进C2C12细胞分化,并靶向钙黏着蛋白1基因参与调控骨骼肌的生长发育。由此可见,miRNA在宁乡猪肌肉发育中也起着关键调节作用。有报道称,不同品种猪差异表达mRNA和circRNA在快速纤维和慢速纤维之间的转换以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢中富集,这些差异表达的lncRNA可能通过lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA调控网络参与猪骨骼肌肌肉增殖、分化及再生,充当miRNA的竞争性内源RNA[41]。但是,目前关于营养因素如何干预lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA调控网络,继而影响宁乡猪肌纤维类型转化的机制的研究鲜有报道,有待进一步探讨。

4 小 结

猪肉品质形成的过程极其复杂,其优劣直接受脂质沉积和肌纤维发育的影响。因此,深入探究肌纤维性状形成及IMF沉积和分布的分子机制对于调控猪肉品质形成具有重要意义。近年来,宁乡猪IMF沉积和肌纤维的生长发育已成为研究的热点,发现营养干预等手段可通过影响宁乡猪脂质代谢和肌纤维发育相关基因改善宁乡猪肉品质。但是,目前关于营养调控宁乡猪不同日龄不同组织中非编码RNA表达,进而调节脂质代谢和肌纤维发育的具体调控机制还有待进一步深入研究和揭示。因此,为充分了解宁乡猪脂质沉积和肌纤维生长发育规律,并通过营养干预手段研究miRNA、lncRNA、circRNA表观遗传修饰调控宁乡猪脂质沉积和肌纤维类型转化将成为主要的研究方向,以更好地解决宁乡猪实际生产中遇到的背膘厚、腹脂过度沉积问题,进而改善宁乡猪肉品质提升其经济效益。