饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪生长性能及内脏组织病理的影响

熊云霞 刘 帅 肖 昊 吴绮雯 易宏波 何冬生 李亚静 蒋宗勇 王 丽*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所,农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室,畜禽育种国家重点实验室,岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心,广东省畜禽育种与营养研究重点实验室,广州 510640;2.诸城市浩天药业有限公司,诸城 262218)

甜叶菊是一类天然高倍甜味剂-甜菊糖苷的主要来源[1]。在中国,甜叶菊提取物(主要是甜菊糖苷)的总产量估计为每年1.5万t,自2016年以来,每年的增长率在5%左右[2]。目前,我国是全球最大的甜叶菊种植国、甜菊糖苷生产及出口国。伴随着甜叶菊的大量种植、提取,产生大量的甜叶菊废渣,将甜叶菊废渣进行简单粗暴的堆积、燃烧、填埋处理不仅造成环境污染,还造成资源的极大浪费[3-4]。甜叶菊废渣富含黄酮类、萜类、寡糖和挥发油等活性物质[5-7]。研究发现,将甜叶菊废渣进行再提取,可得富含绿原酸、异绿原酸及其他酚类物质的提取物,具有良好的抗氧化活性[8],应用于畜禽养殖中具有巨大潜能。富含绿原酸的植物提取物如金银花、杜仲等的提取物,在畜禽养殖中具有良好的促生长及改善肉品质的作用[9-12]。其他植物(如金银花、杜仲)来源的绿原酸类成分中新绿原酸是主要有效成分,而甜叶菊来源的绿原酸中异绿原酸的占比明显高于其他来源,抗氧化活性更高[13]。但是,甜叶菊来源的绿原酸在畜禽饲料中的应用还较少有研究者关注。本课题组前期研究发现,饲喂添加富含绿原酸类物质的甜叶菊废渣提取物的饲粮,可改善肥育猪生长性能、抗氧化活性及肠道菌群,该甜叶菊废渣提取物应用于断奶仔猪饲粮的有效剂量为400 mg/kg[14-15]。本研究以前期研究结果为基础,选用4 000 mg/kg添加量为多倍剂量组,检测断奶仔猪生长性能、血常规及生化指标、抗氧化活性、脏器指数和内脏组织病理变化等,旨在评价甜叶菊废渣提取物在断奶仔猪饲粮中的耐受剂量。

1 材料与方法

1.1 甜叶菊废渣提取物的有效成分

本研究使用的甜叶菊废渣提取物是甜菊糖苷提取后的残渣经甲醇萃取、聚酰胺吸附和树脂解析、极性大孔树脂富集、结晶和再结晶等步骤制备而成。本试验用的甜叶菊废渣提取物外观为深褐色粉末,该产品含有16.66%异绿原酸A、1.62%异绿原酸B、7.36%异绿原酸C、13.69%绿原酸、2.00%新绿酸、1.68%隐绿原酸、1.30%奎尼酸、0.30%咖啡酸、0.60%咖啡酸乙酯、1.50%芦丁、0.50%槲皮素、19.50%β-葡聚糖、1.50%低聚木糖、3.50%水分、6.50%粗灰分、1.70%粗蛋白质和0.10%粗脂肪。绿原酸类物质含量采用高效液相色谱(HPLC)方法检测,水分、粗灰分、粗蛋白质和粗脂肪含量分别参考国标GB/T 6435—2014、GB/T 6438—2007、GB/T 6432—2018及GB/T 6433—2006检测。其他有效成分检测采用基于Thermo Q Exactive HF高分辨率质谱法的非靶向筛选方法,有效成分检测均为课题组自行检测,具体方法详情参考本课题组前期文献[14]。

1.2 试验设计和试验饲粮

选用平均初始体重为(6.79±0.02) kg的21日龄健康杜×长×大断奶仔猪108头,采用完全随机试验设计,根据体重和性别随机分为3组,每组6个重复,每个重复6头,公母各占1/2。试验采用玉米-豆粕型基础饲粮,对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮中添加400、4 000 mg/kg甜叶菊废渣提取物的试验饲粮。甜叶菊废渣提取物有效成分按绿原酸类物质当量折算后,对照组为0,400 mg/kg甜叶菊废渣提取物添加组为395.7 mg/kg,4 000 mg/kg甜叶菊废渣提取物添加组为3 905.3 mg/kg。基础饲粮参照NRC(2012)营养需要标准配制,制作成颗粒料后进行饲喂。基础饲粮组成及营养水平见表1,试验期42 d。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items含量 Content标准全消化道可消化磷 STTD P0.33标准回肠可消化赖氨酸 SID Lys1.40标准回肠可消化蛋氨酸 SID Met0.40标准回肠可消化苏氨酸 SID Thr0.82标准回肠可消化色氨酸 SID Trp0.23标准回肠可消化异亮氨酸 SID Ile0.72标准回肠可消化缬氨酸 SID Val0.89

1.3 饲养管理

本试验在广东省农业科学院动物科学研究所的白云动物试验基地展开。试验猪舍内安装红外保温灯,将猪舍内环境温度维持在26～28 ℃。试验猪每天饲喂3次(07:00、12:00、17:00),添料量以料槽内有少量剩料为准,每天准确记录每个重复的饲粮添加、剩余、损耗量及料槽内清理的霉变料。试验前,清洗料槽和水槽,对猪舍进行彻底消毒,对试验猪进行常规免疫与驱虫。所有试验猪自由饮水和采食。

1.4 检测指标

1.4.1 生长性能

分别于试验开始、第29天和结束时早上称重,计算平均增重。试验过程中准确记录每个重复的采食量,记录猪只的腹泻情况,以计算平均日增重、平均日采食量、料重比及腹泻率。腹泻率:每天早、晚2次观察仔猪粪便情况,记录每个重复腹泻仔猪头次。腹泻评分参考表2,当腹泻评分为2或以上,认为仔猪发生腹泻,腹泻率计算公式如下:

表2 腹泻评分标准

腹泻率(%)=[总腹泻头数/(仔猪头数×

试验天数)]×100。

1.4.2 血常规指标

试验结束,每个重复挑选最接近该组平均体重的猪进行前腔静脉采血,采集1 mL血液于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管,并于24 h内用BC-5000 Vet全自动兽用血常规分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)采用五分类法分析血常规指标,包括白细胞数量(WBC)、红细胞数量(RBC)、血红蛋白(HGB)浓度、红细胞压积(HCT)、平均红细胞压积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、血小板数量(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PVT)等。

1.4.3 血清生化指标

前腔静脉采集10 mL血液于非抗凝采血管,室温静置0.5 h后,4 ℃下3 000 r/min离心10 min,分离出血清,1.5 mL离心管分装后液氮速冻,保存于-80 ℃。血清生化指标采用VITAL全自动生化分析仪(SELECTRA ProXL)检测,均采用中生北控生物科技股份有限公司的试剂盒,参照试剂盒说明书测定。测定指标包括总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆红素(TBILI)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性。

1.4.4 血清抗氧化指标

血清总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量及过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测,参照试剂盒说明书测定。

1.4.5 脏器指数

每个重复选取1头最接近该组平均体重的仔猪进行屠宰。屠宰猪注射戊巴比妥那麻醉后放血,处死后迅速打开腹腔,剥离内脏,用吸水毛巾吸干血水称重,记录心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等的重量。

脏器指数(%)=(脏器重/宰前活重)×100。

1.4.6 组织病理

屠宰猪处死后迅速打开腹腔,剥离内脏,无菌结扎胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠置于冰盒内备用。取胃大弯处、近端十二指肠、远端回肠、中端直肠肠段约1.5 cm组织样品,直接置于4%多聚甲醛;心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、胰腺、肠系膜淋巴结于相同位置均取1 cm3样置于4%多聚甲醛,室温固定过夜。采用常规石蜡切片,苏木精-伊红(HE)染色后镜检。

1.5 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2019整理后,用SPSS 18.0软件进行统计分析,数据以平均值±标准误表示。评估组间差异前,采用Shapiro-Wilk检验数据的正态性。当变量数据呈非正态分布时,采用非参数检验Kruskal-Wallis one-way ANOVA分析并用FDR进行多重校正,当数据呈正态分布时,采用one-way ANOVA分析并用Duncan氏法进行多重比较。以P<0.05为差异显著,0.05≤P<0.10表示有差异显著趋势。

2 结 果

2.1 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪生长性能的影响

如表3所示,在试验第28天和第42天,各组间断奶仔猪体重均无显著差异(P>0.05)。试验第1～28天、第1～42天,与对照组相比,添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪平均日增重、平均日采食量、料重比及腹泻率等均无显著影响(P>0.05)。

2.2 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪血常规指标的影响

如表4所示,与对照组相比,添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪血常规指标如白细胞数量、红细胞数量、血红蛋白浓度、红细胞压积、平均红细胞压积、平均血红蛋白含量、血小板数量、平均血小板体积及血小板压积等均无显著影响(P>0.05)。

2.3 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪血清生化指标的影响

如表5所示,与对照组相比,添加400 mg/kg甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪各血清生化指标如总蛋白、白蛋白、尿素氮、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、总胆红素含量及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶活性均无显著影响(P>0.05);但是,添加4 000 mg/kg甜叶菊废渣提取物可显著提高血清碱性磷酸酶活性(P<0.05)。

表5 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪血清生化指标的影响

2.4 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

如图1所示,与对照组相比,添加400 mg/kg甜叶菊废渣提取物可显著降低断奶仔猪血清MDA含量并显著提高T-SOD、CAT、GSH-Px活性(P<0.05);同时,添加4 000 mg/kg甜叶菊废渣提取物可显著降低断奶仔猪血清MDA含量并显著提高T-SOD活性(P<0.05)。

数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.5 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪脏器指数的影响

如表6所示,与对照组相比,添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及胰腺等脏器指数均无显著影响(P>0.05)。

表6 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪脏器指数的影响

2.6 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪内脏组织病理的影响

如图2所示,各组试验仔猪心肌结构清楚,心肌纤维排列整齐,未见细胞异常;肝脏中肝小叶轮廓清晰,肝细胞排序呈放射状,细胞核大小一致,未见桥接或片状坏死,未见肝纤维化,未见异常病理改变;脾小结清晰可见,脾脏组织结构清楚,未见其他特殊改变;肺脏组织结构清楚,未见纤维化、出血,小动脉和细支气管无重构,肺泡腔无肺泡隔增厚等异常病变;肾脏组织结构清楚,肾小球和肾小管清晰可见,未见肾小球纤维化,未见肾小管、间质血管等出现特殊改变;胸腺中央小体清晰可见,胸腺结构清楚,未见其他特殊改变;胰腺组织内外分泌腺结构清楚,胰岛清晰可见,未见增生;淋巴结结构清楚,可见皮质内淋巴滤泡生发中心,未见其他特殊改变;胃黏膜各层结构清楚,黏膜上皮细胞完整,主细胞和壁细胞清晰可见,未见增生、萎缩或溃疡等;十二指肠黏膜上皮正常,有指状突起的肠绒毛,固有层小肠腺,腺泡正常,黏膜下层有十二指肠腺,其中对照组肠道绒毛断裂倒伏较严重,且肠壁内侧存在较厚黏液层,其余组绒毛断裂倒伏状况有所改善,但是高剂量组亦观察到较厚黏液层;回肠黏膜上皮正常,其中对照组肠道绒毛断裂倒伏较严重;直肠结构正常,4层结构明显,柱状上皮细胞排列整齐,有大量的杯状细胞,固有层有大肠腺。经与对照组比对,未发现高剂量组断奶仔猪内脏细胞和组织结构上的异常。

图2 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪内脏组织病理的影响

3 讨 论

3.1 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪生长性能的影响

本课题组前期研究发现,饲粮添加100 mg/kg的甜叶菊废渣提取物有提高生长育肥猪平均日增重、平均日采食量的趋势,并且可显著提高生长育肥猪胴体重[14];而在饲粮中添加100～400 mg/kg甜叶菊废渣提取物不影响断奶仔猪生长性能,但是400 mg/kg添加量可显著改善其抗氧化活性及肠道菌群[15]。本试验的展开以本课题组前期研究结果为基础,以400 mg/kg为有效组,以4 000 mg/kg添加组为多倍剂量组,本试验中发现,饲粮中甜叶菊废渣提取物添加量提高至4 000 mg/kg对断奶仔猪生长性能亦无显著影响。但是有研究指出,在饲粮中添加1 000 mg/kg绿原酸可提高仔猪的平均日增重,降低料重比[17],此文献中使用的绿原酸产品为绿原酸纯品,而本研究中使用的甜叶菊废渣提取物是一个混合物,虽然绿原酸类物质的总量高达43.28%,但是以异绿原酸A为主,含量为16.66%,绿原酸含量仅为13.69%,这可能是本研究结果与前人研究结果存在差异的原因之一。也有研究指出,饲粮中添加杜仲叶提取物(主要成分为多糖、黄酮类化合物和绿原酸)对仔猪生长性能无显著影响[18]。由于有效成分组成不同,机体代谢途径会有差异,例如绿原酸经口服后小部分在胃和小肠中被吸收,在小肠中绿原酸被糖苷酶和酯酶分解生成咖啡酸和奎宁酸,其中部分咖啡酸经肝肠循环进入肝脏被转化为阿魏酸、异阿魏酸和二氢阿魏酸,最终形成相应的硫酸盐代谢产物;大部分绿原酸未被胃和小肠吸收,直接进入大肠,在肠道菌群作用下生成咖啡酸和奎宁酸,其中咖啡酸或者经肝肠循环代谢,或者在肠道中发生葡萄糖苷酸化代谢,而奎宁酸则在肠道菌群代谢下形成马尿酸和香豆素[19-22]。异绿原酸A在机体内主要经由水解、氢化、脱氢、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等途径代谢,异绿原酸A在肠道中可发生葡萄糖苷酸化反应生成异绿原酸A葡萄糖醛酸结合物,或者经水解脱去1分子咖啡酰基形成单咖啡酰基奎宁酸,单咖啡酰基奎宁酸可进一步发生氢化、脱氢及甲基化形成相应的氢化、脱氢及甲基化产物,单咖啡酰基奎宁酸还可进行进一步水解脱去1分子咖啡酰基形成咖啡酸和奎宁酸,形成的咖啡酸和奎宁酸代谢与前述的绿原酸代谢路径相同[23-24]。由于植物提取物来源不同,有效成分组成各异、动物所处生长阶段不同等,都会造成植物提取物在提高动物生长性能方面的作用存在争议。

3.2 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪血常规及生化指标的影响

血液常规和生化指标对猪的疾病诊断和生长性能有重要的参考价值。血常规指标与机体新陈代谢、健康状况密切相关,血液中各类细胞组分的变化可用于诊断动物的健康状况[25]。本研究发现,添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪血常规指标均无显著影响,说明试验猪只均健康,且添加高剂量甜叶菊废渣提取物也并未对猪只健康状况产生负面影响。血清中碱性磷酸酶的活性反映了脂类的代谢效率,动物生长性能受碱性磷酸酶活性的影响,有报道称,动物日增重与血清碱性磷酸酶活性呈正相关[26]。饲粮中添加甘草黄酮粉可以提高断奶仔猪血清碱性磷酸酶活性[27]。而本研究也发现,添加高剂量甜叶菊废渣提取物可显著提高断奶仔猪血清碱性磷酸酶活性,可能与其促生长潜力有关。

3.3 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

Zhao等[8]发现,甜叶菊废渣提取物富含绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮苷和槲皮素等抗氧化活性良好的一类酚类及黄酮类物质,占比达到39.83%,其中以异绿原酸C含量最高[(126.7±1.27) mg/g],随后是咖啡酸[(97.2±0.36) mg/g]和绿原酸[(46.5±0.29) mg/g][28],可通过激活蛋白激酶B(Akt)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)通路,清除机体多种自由基,显著提高氧化应激小鼠血清中T-AOC和T-SOD活性,降低MDA含量[29]。由于提取工艺不同,本研究中使用的甜叶菊废渣提取物所含绿原酸类组成与含量与其略有不同。本研究中使用的甜叶菊废渣提取物主要有效成分也是绿原酸类物质,所含绿原酸类物质含量为43.28%,其中以异绿原酸A含量最高,含量为16.66%。酚类物质所含的酚羟基与自由基发生反应,从而发挥其清除自由基和抗氧化的生物活性,且抗氧化活性强弱由羟基位置和数量决定,从这个角度出发,异绿原酸A的抗氧化活性会优于绿原酸[30]。本课题组前期研究发现,添加甜叶菊废渣提取物于生长育肥猪或者断奶仔猪,均可提高其机体抗氧化活性,降低MDA含量,并提高SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活性[14-15]。同样的,本试验发现,高剂量甜叶菊废渣提取物亦可改善断奶仔猪血液抗氧化性能,显著降低血清MDA含量和提高T-SOD活性。

3.4 饲粮添加甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪脏器指数及组织病理的影响

器官指数对健康动物来说相对稳定,其大小的变化能反映器官充血、增生或萎缩及退行性变化等。此外,器官指数也可旁证组织形态学改变的可能性。课题组前期研究发现,生长育肥猪饲粮添加100～800 mg/kg甜叶菊废渣提取物未对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等脏器指数造成显著影响[14]。同样的,本研究也发现,添加甜叶菊废渣提取物对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胰腺等的脏器指数无显著影响,说明即使添加高剂量甜叶菊废渣提取物也未对断奶仔猪内脏器官的正常发育产生影响。并且,添加甜叶菊废渣提取物组的断奶仔猪各器官的组织病理切片与对照组差异不大,并无细胞和组织结构上的异常,因此添加高剂量甜叶菊废渣提取物对组织病理特征无明显影响。断奶应激会导致仔猪肠道绒毛倒伏、断裂[31],绿原酸可以改善断奶仔猪肠道形态[32-33],提高肠道紧密连接蛋白表达,降低肠道渗透性,改善肠道菌群,增加有益菌如乳杆菌的丰度,降低有害菌如大肠杆菌的丰度[32]。与前人研究结果一致,本课题组前期研究也发现,饲粮中添加甜叶菊废渣提取物显著提高了肠道有益菌普氏菌属及蔷薇菌属的相对丰度[15]。而本研究发现,添加高剂量甜叶菊废渣提取物对断奶仔猪肠道形态有一定的改善作用。本课题组前期试验中甜叶菊废渣提取物的添加范围为100～400 mg/kg,可能是由于添加量不同导致对肠道损伤缓解效果的不同。

4 结 论

综上所述,饲粮中添加甜叶菊废渣提取物可改善断奶仔猪抗氧化性能,且对断奶仔猪生长性能、血常规指标、脏器指数等均无显著影响,组织病理学观测未发现心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等有明显病理变化。因此,断奶仔猪可耐受饲粮中4 000 mg/kg甜叶菊废渣提取物。