不同比例葡萄籽饲粮对生长猪生长性能、血清生化指标、抗氧化性能和粪便微生物组成的影响

薛瑞鑫 王 丹 李佳橙 匡 宇 冯家骐 南珊珊 聂存喜*

(1.石河子大学动物科技学院,石河子 832000;2.兵团第八师畜牧兽医工作站,石河子 832000)

近年来,随着畜牧业规模化、集约化的发展,玉米及其副产品、豆粕等饲料资源的缺乏问题愈加明显,人畜争粮的现象凸显,严重制约了畜牧业的可持续发展[1-2]。因而开发利用非常规饲料资源成为了当前研究的重点,也是解决这一问题的有效途径[3-4]。新疆是葡萄生长的黄金地带之一,每年会产出大量的葡萄用于榨汁、酿酒,在葡萄酿酒工艺过程产生的副产物葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗约占新鲜葡萄果重的20%,葡萄籽含有丰富的维生素和矿物质元素,是一种理想的纤维型饲料原料[5]。除去粗纤维、脂肪与碳水化合物含量,葡萄籽与玉米其余营养成分相近。研究表明,在妊娠期母猪饲粮中添加4%～10%葡萄籽粕来替代玉米,在哺乳期母猪饲粮中添加7%的熟化葡萄籽粉替代玉米,能提升其繁殖性能[6]。另外,葡萄籽内富含原花青素,具有极强的抗氧化能力。研究表明,添加葡萄籽原花青素能够提高肉鸡和生长育肥猪的抗氧化性能,改善动物机体的免疫能力[7-8]。在饲粮里的适量替代比例,有利于实现葡萄籽的高效利用,缓解饲料资源短缺的现状[9]。因此,本试验以生长猪为研究对象,用葡萄酿酒后产生的副产物葡萄籽为试验材料,研究饲粮中添加不同比例的葡萄籽对生长猪生长性能、血清生化指标、抗氧化性能以及粪便微生物组成和多样性的影响,为葡萄籽的高效利用及其在生长猪上的应用提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

本试验采用单因素试验设计,按出生日龄、体重相近原则选择80头健康状况良好的杜×长×大三元杂交生长猪,公母各占1/2,随机分为4组,分别为对照组(Ⅰ组)、2%葡萄籽添加组(Ⅱ组)、5%葡萄籽添加组(Ⅲ组)、8%葡萄籽添加组(Ⅳ组),每组4个重复,每个重复5头猪。

1.2 试验饲粮

基础饲粮参照《猪营养需要》(GB/T 39235—2020)配制,试验饲粮组成及营养水平见表1。参照《饲料分析及饲料质量检测技术》对饲粮中粗蛋白质、粗脂肪等营养物质含量进行测定。

1.3 饲养管理

试验期间,按比例添加葡萄籽,替代基础饲粮中的玉米,搅拌均匀,每天根据前1天的剩料量确定下一次的投料量,早晚观察生长猪的精神状态,所有猪自由采食和饮水。定期对猪舍消毒,具体按照猪场常规程序进行。

1.4 样品采集

试验前期(第1～14天)和试验后期(第15～28天)饲养结束时,每组分别从每个重复中随机选取2头猪,颈静脉采血10 mL,静置30 min后用低速离心机以2 000 r/min离心15 min,收集血清于-20 ℃冷冻保存,待测血清生化指标。此外,按照重复采集各组的新鲜粪便,分装至10 mL离心管中并立即放于-80 ℃冰箱保存,用于测定粪便菌群。

1.5 指标测定

生长性能测定:试验分别于第1天、第14天和第28天空腹称重,计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)。

血清生化指标与抗氧化指标测定:总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量以及总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)与过氧化氢酶(CAT)活性等指标,均使用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒进行检测,具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。

粪便菌群分析:基于Illumina Miseq平台,对采集的粪便样品16S rRNA的V3～V4区域进行高通量测序。通过对所得原始测序序列进行过滤、双端拼接,得到优化序列,再将其进行聚类,划分操作分类单元(OTU),利用美吉生物云平台进行物种Alpha多样性和菌群组成分析。

1.6 数据处理与分析

使用Excel 2019整理试验数据,采用SPSS 21.0软件使用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析,使用Duncan氏法进行多重比较,结果以“平均值±标准误”表示。P<0.05为差异显著性判定标准。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪生长性能的影响

由表2可知,与Ⅰ组相比,饲粮中添加葡萄籽对生长猪各阶段的末重、平均日增重、平均日采食量和料重比均无显著影响(P>0.05)。

表2 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪生长性能的影响

2.2 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪血清生化指标的影响

由表3可知,第14天,与Ⅰ组相比,Ⅲ组的血清尿素氮含量显著降低(P<0.05),且Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)。第28天,Ⅱ组血清甘油三酯含量显著低于Ⅰ组(P<0.05),且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组间差异不显著(P>0.05)。其余血清生化指标各组间均无显著变化(P>0.05)。

表3 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪血清生化指标的影响

2.3 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪血清抗氧化指标的影响

由表4可知,第14天,与Ⅱ组相比,Ⅳ组血清总抗氧化能力显著降低(P<0.05),Ⅰ、Ⅲ组差异不显著(P>0.05),且Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组差异不显著(P>0.05)。与Ⅰ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低(P<0.05),且试验组间差异不显著(P>0.05)。与Ⅰ、Ⅱ组相比,Ⅲ、Ⅳ组血清过氧化氢酶活性显著降低(P<0.05)。第28天,与Ⅰ、Ⅱ组相比,Ⅲ、Ⅳ组血清总抗氧化能力显著降低(P<0.05)。Ⅳ组比Ⅱ组血清谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组间差异不显著(P>0.05)。

表4 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪血清抗氧化指标的影响

2.4 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪粪便菌群的影响

2.4.1 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪粪便菌群多样性的影响

由表5可知,各组的Coverage指数均在0.99以上,说明测序质量高,得到的结果具有代表性。与Ⅰ组相比,试验组Shannon指数、Simpson指数、ACE指数和Chao指数差异均不显著(P>0.05)。由图1可知,第1～14天,主成分1(PC1)的贡献值为17.08%,主成分2(PC2)的贡献值为12.02%,粪便样点基本集中分布;第15～28天,主成分1的贡献值为15.12%,主成分2的贡献值为13.20%,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组粪便样点区分不明显且集中分布,Ⅳ组粪便样点相对分散。

图A:试验前期;图B:试验后期。N1、N2、N3、N4:试验前期Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组;D1、D2、D3、D4:试验后期Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组。下图同。

表5 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪粪便菌群α-多样性的影响

2.4.2 粪便菌群组成分析

由图2可知,生长猪粪便菌群在门水平上的优势菌门共有3个,分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。对粪便样本进行优势菌门的组间差异显著性检验分析,结果表明在门水平,Ⅰ组与试验组肠道微生物组成无显著差异(P>0.05)。

由图3可知,生长猪粪便菌群在属水平上的优势属共有14个,分别为链球菌属(Streptococcus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、狭义梭菌属1(Clostridium_sensu_stricto_1)、普雷沃氏菌科NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)、乳杆菌属(Lactobacillus)、土孢杆菌属(Terrisporobacter)、norank_f_Muribaculaceae、UCG-005、Parabacteroides、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、未标记梭菌属UCG-014(norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014)、未分类毛螺旋菌科(unclassified_f_Lachnospiraceae)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)和拟杆菌属(Bacteroides)。对粪便样本进行优势属的组间差异显著性分析,结果如图4所示,第14天,与Ⅰ组相比,试验组毛螺旋菌科UCG-010(Lachnospiraceae_UCG-010)相对丰度显著降低(P<0.05),Ⅲ组Terrisporobacter相对丰度显著降低(P<0.05);Ⅱ、Ⅲ组泰氏菌属(Tissierella)相对丰度显著升高(P<0.05)。第28天,与Ⅰ组相比,试验组Streptococcus和Lactobacillus相对丰度显著降低(P<0.05),Prevotella相对丰度显著升高(P<0.05)。

Firmicutes:厚壁菌门;Bacteroidetes:拟杆菌门;Proteobacteria:变形菌门;Others:其他。

3 讨 论

3.1 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪生长性能的影响

生长性能是反映动物生长最直接的指标,与经济效益密切相关。苏秀侠等[6]在使用熟化葡萄籽粉替代部分玉米饲喂猪鸡的试验中发现,在育肥猪30～60 kg时,添加比例为3%,60 kg以后,以6%比例添加熟化葡萄籽粉生长性能最好。本试验研究结果表明,与Ⅰ组相比,使用葡萄籽等比例替代部分玉米不影响生长猪的生长性能,其中5%的添加比例生长性能最佳。由此可知,添加量的不同对于生长性能的影响有所差异,除了计量之外与葡萄籽是否研磨熟化有关,未熟化的葡萄籽消化效率和适口性均不及熟化葡萄籽粉。此外,葡萄籽中富含粗纤维,适量的粗纤维具有促进猪肠道蠕动的作用,但过量的粗纤维会加快肠道排空速度,降低猪对饲粮的利用率和生长性能[10]。研究表明,生长猪采食6%粗纤维水平的饲粮,料重比显著低于采食8%和10%粗纤维水平饲粮,其中8%的粗纤维水平饲粮的营养物质消化率显著高于6%粗纤维和10%的粗纤维水平饲粮[11]。在本试验中,随着饲粮中葡萄籽添加比例的增加,粗纤维含量也随之增加,在生长阶段的后期料重比有所增加,但对生长猪全期的生长性能无显著影响。这表明葡萄籽中纤维含量对于生长猪生长性能的影响与其生长阶段和使用时间长短有关。

Terrisporobacter:土孢杆菌属;Lachnospiraceae_UCG-010:毛螺旋菌科UCG-010;Tissierella:泰氏菌属;Streptococcus:链球菌属;Prevotella:普雷沃氏菌属;Lactobacillus:乳杆菌属。

3.2 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪血清生化指标的影响

血清生化指标与动物的生长、代谢密切相关,可以体现机体对营养物质的利用情况以及自身健康状态和生长性能等状况[12-13]。血清中总蛋白、白蛋白含量变化反映了膳食蛋白质吸收和代谢在动物机体中的水平[14],在体内能够调节血浆胶体渗透压、运输营养物质[15],同时与机体的免疫状况相关。动物健康时,二者呈正相关:其含量越高,机体越健康[16]。Aditya等[17]在饲喂肉鸡葡萄渣饲粮后,发现葡萄渣处理组中的血清胆固醇含量、胸肉丙二醛含量均有降低,这说明葡萄渣可以降低血液和重要器官组织的氧化应激;也有研究发现,在蛋鸡饲粮中添加葡萄渣粉能够改善血清生化指标[18]。本研究发现,采食葡萄籽后猪生长前期的血清中总蛋白与白蛋白含量与对照组相比均有所提高,后期血清中总蛋白含量有所降低,提示葡萄籽在一定程度上可促进猪机体健康,但是需要注意使用时间和添加量。尿素氮与体内氮沉积和蛋白质利用率呈负相关,可以反映动物蛋白质代谢状况,是反映蛋白质沉积的一个指标[19-22]。尿素氮含量越低,说明动物机体内氨基酸分解越弱[23],蛋白质利用率提升,含量增加;反之则说明蛋白质利用率下降。本研究表明,添加5%～8%的葡萄籽,猪血清中尿素氮含量降低,这表明葡萄籽有利于猪对蛋白质的利用。

甘油三酯与总胆固醇是衡量动物机体代谢能量平衡和脂肪代谢程度的重要指标,当其在体内含量降低时,说明机体脂肪代谢能力加强[24]。本研究表明,饲粮中添加葡萄籽后猪血清中甘油三酯与总胆固醇含量降低,且试验后期,Ⅱ组血清甘油三酯含量显著下降,其一可能是因为随着饲粮中葡萄籽含量的增加,摄入脂类增多,促进了机体对脂类物质的消化,使得血清甘油三酯与总胆固醇含量降低;其二可能是葡萄籽中亚油酸等不饱和脂肪酸占比较大,进入机体后能消耗体内积存的胆固醇,研究表明葡萄籽油具有降血脂的作用[25]。由此可知,饲喂添加葡萄籽的饲粮,对生长猪脂质代谢和蛋白质代谢无不良影响,能一定程度上提高脂质和蛋白质利用率。

3.3 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪抗氧化性能的影响

氧化应激是促氧化状态、抗氧化防御和酶活性变化之间不平衡的结果[26]。总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶是反映机体抵抗氧化应激的重要指标,总抗氧化能力综合体现了机体对外界氧化的抵抗能力[27],谷胱甘肽过氧化物酶的活性受营养水平的影响,与机体健康状况密切相关[28]。张瑞鑫[29]的研究表明,用酿酒后的葡萄渣做饲粮喂养绵羊,可明显减少其空肠上皮细胞凋亡,并在减少肠道中活性氧(ROS)及丙二醛含量的同时,增强超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,进而增强肠道的抗氧化功能,减轻氧化应激导致的不利后果。舍饲容易引起动物的氧化应激,添加10%葡萄渣的饲粮能够显著提高机体总抗氧化能力,减缓这种氧化应激[30]。本试验中,在试验前期,生长猪抗氧化能力降低,可能是因为机体机能还未完善,以及饲粮的骤然更替[31];同时,葡萄籽低水平的添加量对机体的不利影响也最小。在试验后期,随着机体的生长发育,各项机能完善,试验组抗氧化能力逐渐恢复。葡萄籽内含有原花青素,这是国际公认的具有超强抗氧化物质,本试验中抗氧化能力降低,与这一事实不符,可能是因为所用葡萄籽来源于酒厂,而原花青素能够溶解于水、甲醇、乙醇等极性溶剂[32],导致其中原花青素绝大部分已被提取。同时葡萄籽中富含脂肪酸,多不饱和脂肪酸(PUFA)占总脂肪酸的66.59%～83.09%[15],随着添加比例的上升,容易发生脂质过氧化,不利于动物健康,但随着机体的生长发育,不利影响也随之降低。

3.4 饲粮中添加不同比例葡萄籽对生长猪粪便菌群的影响

粪便菌群与肠道菌群密切相关,其中优势菌群与肠道菌群的平衡密切相关[33],对肠道的结构功能、营养物质的消化吸收和代谢以及机体的免疫调节功能等方面具有重要的作用[34],它的变化影响着动物的生长与发育情况。

Alpha多样性能反映样本中微生物群落的多样性、丰富度和稳定性,是宿主肠道健康的重要凭证。Beta多样性通过对不同微生物群落间的物种多样性进行组间比较分析,探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性。Ace指数和Chao指数与物种的种类和丰富度呈正相关;Shannon指数和Simpson指数分别与物种的多样性和均匀度呈正相关和负相关。Simpson指数越小,Shannon指数越大,说明群落的物种多样性越高[35]。本试验中,试验前期,Ⅲ组Shannon指数最高,Simpson指数最低,Ⅱ组ACE指数和Chao指数最高;试验后期,Ⅳ组Shannon指数、ACE指数和Chao指数最高,Ⅱ组Simpson指数最低。这说明试验前期5%的葡萄籽添加比例能提高菌群物种多样性,2%的葡萄籽添加比例能提高菌群丰富度;试验后期,8%的葡萄籽添加比例能提高物种多样性和丰富度,2%的葡萄籽添加比例有益于物种多样性。生长猪饲喂添加了葡萄籽的饲粮后,粪便菌群的Shannon指数、Simpson指数、ACE指数和Chao指数整体差异不显著,说明饲粮添加2%～8%的葡萄籽进入生长猪肠道后对生长猪肠道微生物的多样性、丰富度和稳定性无负面影响。这可能是因为饲粮的营养组成相似,有研究表明饲粮营养组成相似时,即使饲粮发生了变化,也不会使机体肠道菌群发生较大改变[36]。

诸多研究表明,Firmicutes和Bacteroidetes为猪粪便微生物菌群中的优势菌门,相对丰度高于90%,二者均为微生物区系的重要成员,其他菌门占比不高。二者能分别促进纤维分解和碳水化合物的降解,关系着机体对养分的吸收,有益于机体健康[37-40]。猪肠道微生物菌群的不同组成与自身的生长性能也有密切关系[41],本试验中,生长猪粪便菌群在门水平上的优势菌门均为Firmicutes与Bacteroidetes,与前人研究结果一致,且各组二者相对丰度无显著差异,表明饲粮中添加2%～8%的葡萄籽不影响生长猪对营养物质的消化吸收,也不影响其生长性能。

研究表明,在断奶仔猪基础饲粮中添加5%葡萄渣,并不会对仔猪的生长性能造成任何不利的影响,但是却可以增加其盲肠中某些有益菌群的含量,从而增强仔猪对疾病的抵抗力[42]。Biscarini等[43]研究发现,饲喂葡萄渣作为牛的天然多酚来源后,瘤胃微生物区系的多样性增加。本试验中,Streptococcus、Prevotella、Clostridium_sensu_stricto_1、UCG-005、Lactobacillus等均为优势菌属。它们在肠道中广泛生长,与机体健康息息相关。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组Streptococcuss和Lactobacillus相对丰度显著降低,Prevotella相对丰度显著升高。Streptococcus在满足一定条件时,具有诱导发病的潜在风险;Lactobacillus能够阻止病原菌对肠道的侵害,能够抑制病原菌入侵繁殖,抵抗病原菌感染,抑制内毒素的产生,因此对肠道微生态平衡的维持有很大意义。Prevotella可帮助机体降解纤维素,对动物健康有益[44],其相对丰度升高的原因可能是随着葡萄籽添加比例的提高,机体摄入粗纤维含量的增加,由此促进肠道蠕动加快纤维分解,使得Prevotella相对丰度有所增长。温晓鹿等[45]研究发现,高纤维水平的饲粮能够降低仔猪肠道内的pH,因此Streptococcus相对丰度降低的原因可能是在饲粮内膳食纤维的影响下,肠道内的pH降低,不利于Streptococcus的生长。

综上所述,饲粮添加2%～8%的葡萄籽对生长猪肠道微生物多样性无不利影响,且一定程度上有利于机体健康。

4 结 论

① 在生长猪饲粮中添加2%～8%的葡萄籽对其生长性能无显著影响,能一定程度上提高猪对脂质和蛋白质的利用率。

② 在生长猪饲粮中添加2%～8%的葡萄籽会一定程度上影响猪的抗氧化性能,且与使用时间有关。

③ 饲粮中添加2%～8%的葡萄籽对生长猪粪便微生物的多样性无显著影响,但会显著降低Streptococcuss的相对丰度,显著提高Prevotella的相对丰度。